一、研究目的及背景由于猪的食性、解剖生理特点、以及药物代谢特点与人类的相似性,以猪进行药物的药理、毒理、药代、药效的研究日渐增多。随着动物保护运动的兴起,“3R”原则逐渐推广,非人灵长类及犬等高等动物使用受到限制,猪等食用动物的应用逐渐增多。因此,猪作为药物评价的实验动物具有良好前景。而小型猪由于体型小的优势,其实验操作方便,易于标准化质量控制,饲养成本低,其应用独具优势,也是目前在医学生物学研究中的常规实验用猪。作为药物评价模型,要求模型动物的药物代谢反应机制以及药物与机体与之间的相互作用方面与人具有相似性,利用模型动物能够较为准确地模拟药物在人体内的代谢过程。药物在体内的过程大致可以分为吸收、分布、代谢和排泄四个阶段。药物的药代动力学性质及其生物利用度、毒副作用及药物相互作用都由这四个阶段决定。其中药物代谢的主要场所是肝脏。肝脏进行生物转化则依赖于微粒体中的多种酶系,其中最重要的是细胞色素P450混合功能氧化酶系统。由于该酶系广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等组织器官,因此由P450酶系催化的氧化还原反应可发生在体内许多部位,但仍然以肝脏为主。P450酶系普遍存在于各种脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌中。该酶系组成复杂,由基因多样性控制,称为P450基因超家族。到目前为止,根据最新公布的数据,仅动物就存在101个P450家族,2345个基因序列。P450基因家族和人类的个体化用药及药物的毒副作用密切相关,因此人类的P450已经研究得比较深入,目前发现57个P450功能基因。而作为成熟模式生物和人类疾病动物模型的小鼠则已发现102个P450功能基因。猪作为一种具有重要应用前景的药物评价动物及医学生物学实验动物,其P450基因的研究相对缺乏,目前通过国际细胞色素P450命名委员会命名的仅有30个功能基因。公开数据库中海量增长的序列信息为我们发现新基因提供了充足的资源。EST作为基因的部分cDNA序列,利用其发现和克隆新基因已成为获取新基因并进行功能研究的重要途径。对数据库中大量EST进行分类、整合、组装,可直接获得大片段或全长cDNA序列。用该方法也可以快速、经济地获得基因家族的新成员。猪EST数据库中的序列数已达到60万条以上,这些数据为我们提供了发现猪P450家族基因信息的机会。细胞色素P450酶的遗传多态性对其药物代谢有重要影响,也是和目前人类个体化用药相关的主要因素之一。不同个体在P450基因多态性的产生,可能会造成对同一药物反应的差异,有时由于这种个体间遗传学上的差别,同一药物在不同个体内的效果和毒副作用的差异可以达到300倍之多。根据人类细胞色素P450命名会员会的资料,仅人的CYP3A4目前就有已经证实的40个多态基因(或叫突变体)。中国大陆人主要突变体是CYP3A4*4,该突变使CYP3A4酶活性降低。研究已经证明,对于人类肝脏含量最高,也是代谢药物最多的CYP3A亚家族,其最合适的动物模型是(小型)猪。猪的肝脏微粒体具有人CYP3A4探针底物的代谢活性和相同的抑制剂特性,并认为猪的CYP3A29可能是人CYP3A4的同源酶。那么猪CYP3A29是否具有同样的多态性呢?如果这样的多态性存在的话,其是否会影响其参与代谢途径的代谢活性呢?如果CYP3A29存在遗传多态性且影响其代谢活性的话,用猪作为人类CYP3A4底物药的代谢模型就必须要考虑其影响效果。我国具有丰富和优秀的小型猪资源品系。巴马香猪和贵州小型香猪作为其代表品种之一,其来源均为香猪,主要产于我国贵州省从江、三都、和广西环江、巴马等少数民族聚居地区。这些地区多属偏僻山区,交通闭塞,不仅其它猪种的血缘难以进入,而且群众习惯于将猪进行亲子交配,同胞、半同胞交配等高度近交的自繁自养方式。并且由于长期的自然选择,虽近交程度较高,却少见遗传疾病及畸形,从而形成独特小型猪群体。巴马香猪和贵州小型香猪均以小型化为育种目标进行了定向选育。其中巴马香猪近交程度高、被毛呈白色,而且耐近交、遗传稳定、个体表型一致,在医学生物学领域应用中证明是优秀的模型动物,并积累了丰富的解剖、生理生化及基础生物学特性背景资料。对巴马香猪和贵州小型香猪进行其细胞色素P450基因的相关研究,将对其作为药物评价动物模型的应用具有重要意义。因此,本研究利用公开数据库的序列资源,用生物信息学方法预测猪的细胞色素P450新基因,以此对我国资源小型猪品系巴马香猪进行相关基因的克隆,为我国独特小型猪品系作为药物评价动物模型提供基础依据;同时研究巴马香猪和贵州小型香猪细胞色素P450关键亚型CYP3A29的品系间及品系内多态性,评估其序列多态差异对药物代谢动物模型的影响;对两种小型猪品系进行微卫星遗传背景检测分析,观察动物品系间与品系内微卫星遗传背景差异与其CYP3A29基因多态的相互关系。二、研究内容和结果1.猪细胞色素P450基因的生物信息学预测和分析根据其它哺乳动物的同源P450基因序列,主要利用猪现有的EST数据库,用生物信息学方法对猪P450家族基因进行电子克隆,获得猪细胞色素P450家族新基因;并对猪细胞色素P450基因进行EST电子表达谱、可变剪接等分析。结果:应用生物信息学方法预测获得37个可能的猪细胞色素P450新基因序列,利用EST电子表达分析获得了猪不同组织的P450基因表达数据,发现了猪P450基因的46个可变剪接体,为小型猪药物代谢研究提供了P450基因的基础数据和资料。通过生物信息学方法共得到37个可能的猪细胞色素P450新基因序列,分布于11个家族,19个亚家族,23个亚型。其中9条具有全长编码区序列。序列分析表明预测得到的序列均具有P450结构域或与其它物种相应P450序列高度相似,聚类分析表明其和已知猪的P450基因或人的相应P450基因具有同源性。对已知和预测的共52个猪P450基因进行EST电子表达谱分析,获得了其不同组织的P450基因表达数据,其中在猪的肝脏表达量最高的P450基因依次是CYP2D25(50.26%)、CYP2E1(31.09%)、CYP2C33(3.69%)、CYP2A19(3.11%)、CYP2D21(2.07%),并和人的EST电子表达谱进行了比较。发现了猪P450基因的46个可变剪接体,其中编码区的可变剪接有31个,5’UTR的可变剪接有3个,3’UTR的可变剪接有9个,另有2个可变剪接同时发生在编码区和3’UTR,1个可变剪接同时发生在编码区和5’UTR。2.巴马香猪预测细胞色素P450基因的克隆和验证根据对猪细胞色素P450基因序列的预测结果,设计引物通过RT-PCR扩增相应基因序列,进行TA克隆和序列测定,与预测的P450基因序列进行比较。结果:克隆获得了我国资源小型猪品系巴马香猪的18个细胞色素P450新基因序列,均已在GenBank登录,登录号EF625344-EF625358,并已提交国际细胞色素P450命名委员会进行命名,不仅为小型猪药物代谢研究提供了P450基因序列资料,同时表明用生物信息学方法结合实验验证是快速高效获得猪P450新基因的有效途径。对预测的猪细胞色素P450基因19个序列的RT-PCR克隆验证均获得了符合预期片段大小的扩增产物,经序列测定和比对,17个P450基因的克隆序列和生物信息学预测结果基本一致,1个克隆序列可能为猪cyp4f6基因的一个新等位基因。其中1个克隆序列cyp4f2v4和预测序列相差较大,blastx检索NCBI未发现相似P450序列,因此把这条序列不作为猪的P450基因序列。cyp4f3v1的扩增序列和原来差异较大,但和cyp4f6v1序列非常相似,并能和cyp4f6v1*1、cyp4f6v1*2、cyp4f6v1*3其同拼接成一条contig,将这条contig用blastx检索NCBI,未发现相同序列,但和CYP4F6亚家族有高度相似,故其应为猪cyp4f6基因的一个新变体。其余序列均和预测结果基本一致,cyp39a1通过分段扩增,cyp39a1*1和cyp39a1*2可拼接成一个contig,其编码蛋白和预测序列完全相同,应该包含了其编码区全长。所有和预测序列一致的序列均已在GenBank登录,登录号EF625344-EF625358。所有序列已提交国际细胞色素P450命名委员会进行命名。3.小型猪细胞色素P450基因CYP3A29多态研究设计引物通过RT-PCR扩增不同个体巴马香猪和贵州小型香猪的CYP3A29基因编码区全长,进行TA克隆和测序,通过序列比对检测和发现其多态性位点,并对其多态位点的分布和影响进行分析。结果:发现了巴马香猪和贵州小型香猪CYP3A29基因的6个SNP位点及1个可变剪接体,其SNP分布具有品系及个体间多态性,在不同品系中可呈不同的SNP类型,其中巴马香猪具有品系内SNP类型的一致性,贵州小型香猪品系内具有SNP类型差异,说明猪P450基因具有和人相似的遗传多态性,在猪作为药物代谢模型的应用中应关注品系及个体间的差异。共获得13头巴马香猪和5头贵州小型香猪的CYP3A29基因序列,比对结果表明,其中具有6个可能的SNP位点,1个可变剪接体,1个可能的猪CYP3A29亚家族新基因。6个可能的SNP位点中,5个均为同义替换,不改变编码的氨基酸类型,对编码的蛋白序列无影响,1个由于碱基缺失引起移码突变和翻译提前终止。CYP3A29*1A、CYP3A29*1B、CYP3A29*1C三个SNP位点,均表现为品系间的差异,即巴马香猪和贵州小型香猪各为一个SNP亚型;位点CYP3A29*1E和CYP3A29*2则表现小型猪品系和其它品系间的序列差异;CYP3A29*1D位点1头贵州小型香猪和其它贵州小型香猪为不同的SNP类型。贵州小型香猪G3a2902发现一个可变剪接,其在499-587位发生片段缺失,并产生移码使编码蛋白被截断。在巴马香猪B3a2914发现一个非特异序列,其可能是猪CYP3A亚家族的一个新成员。4.实验小型猪群体的微卫星遗传学检测选用美国猪基因组协作计划推荐用于全球猪遗传多样性研究的21个微卫星标记,采用微卫星荧光标记-半自动基因分型方法,对实验所用的2个小型猪群体-巴马香猪和贵州小型香猪进行遗传学检测和评估,鉴定其遗传背景和遗传关系,分析其个体间相似性和差异程度。结果:巴马香猪和贵州小型香猪具有较好遗传稳定性,群体内具有良好遗传多样性,巴马香猪的个体均一性要好于贵州小型香猪,两群体间有较大遗传差异,其遗传稳定性说明两种小型猪是适宜医学生物学研究的封闭群实验动物,与人群的遗传状况相似;同时其品系间及品系内的遗传差异与其P450基因的SNP多态分布相符,进一步说明在猪作为药物代谢模型的应用中应关注品系及个体间的差异。两种小型猪及对照荣昌猪和大白猪在所检21个微卫星位点均具有良好遗传多样性,共检测到等位基因281个,每位点7-22个,巴马香猪、贵州小型香猪、荣昌猪、大白猪分别为132、125、174和119个,巴马香猪检测到的等位基因数要大于贵州小型香猪,但巴马香猪的遗传多样性指数Shannon信息指数和多态信息含量均低于贵州小型香猪,其遗传杂合度低于贵州小型香猪,纯合度高于后者,提示巴马香猪个体间的相似程度要大于贵州小型香猪。两种小型猪间的遗传分化指数Fst为0.2270,Nei标准遗传距离为0.9134,提示其群体间遗传分化较大,具有较大遗传差异。Hardy-Weinberg遗传平衡检测表明,两种小型猪的21个位点中均有7个偏离平衡,荣昌猪和大白猪则分别有10和11个偏离平衡,表明两种小型猪在繁育过程中能够较好地保持遗传稳定性。三、研究结论1.应用生物信息学方法预测获得37个可能的猪细胞色素P450新基因序列,分布于11个家族,19个亚家族,23个亚型;利用EST电子表达分析获得了猪不同组织的P450基因表达数据,发现了猪P450基因的46个可变剪接体。为小型猪药物代谢研究提供了P450基因的基础数据和资料。2.克隆获得了我国资源小型猪品系巴马香猪的18个细胞色素P450新基因序列,均已在GenBank登录,登录号EF625344-EF625358,并已提交国际细胞色素P450命名委员会进行命名,不仅为小型猪药物代谢研究提供了P450基因序列资料,同时表明用生物信息学方法结合实验验证是快速高效获得猪P450新基因的有效途径。3.发现了巴马香猪和贵州小型香猪CYP3A29基因的6个SNP位点及1个可变剪接体,其SNP分布具有品系及个体间多态性,在不同品系中可呈不同的SNP类型,其中巴马香猪具有品系内SNP类型的一致性,贵州小型香猪品系内具有SNP类型差异,说明猪P450基因具有和人相似的遗传多态性,在猪作为药物代谢模型的应用中应关注品系及个体间的差异。4.巴马香猪和贵州小型香猪具有较好遗传稳定性,群体内具有良好遗传多样性,巴马香猪的个体均一性要好于贵州小型香猪,两群体间有较大遗传差异,其遗传稳定性说明两种小型猪是适宜医学生物学研究的封闭群实验动物,与人群的遗传状况相似;同时其品系间及品系内的遗传差异与其P450基因的SNP多态分布相符,进一步说明在猪作为药物代谢模型的应用中应关注品系及个体间的差异。