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目的:分析黄花蒿花粉对人鼻黏膜上皮细胞株(Human Nasal Mucosa Epithelial Cells,HNEpC)紧密连接的影响作用,明确黄花蒿花粉对HNEpC细胞膜Occludin、Claudin-1蛋白表达及定位改变的影响,及其与p38MAPK信号通路激活的关系,找到黄花蒿花粉诱发和加重变应性鼻炎的可能作用机制,为未来临床预防和治疗花粉致敏的变应性疾病提供新的靶点和治疗途径。方法:1.体外培养HNEpC细胞株,采用不同浓度黄花蒿花粉(0、20、40、80、100、160、200μg/mL)分别干预细胞24 h,CCK-8法检测细胞活力;免疫荧光化学染色法观察紧密连接Occludin、Claudin-1在细胞膜上表达和分布情况;Western Blot检测细胞内信号转导通路p38MAPK及其磷酸化蛋白p-p38MAPK水平;Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测紧密连接Occludin、Claudin-1的蛋白和mRNA含量。2.在上述实验基础上,先用50μmol/L p38MAPK抑制剂(SB203580)预处理细胞1 h,再用200μg/mL黄花蒿花粉干预24 h,最后采用免疫荧光化学染色法、Western Blot和实时荧光定量PCR分别检测紧密连接Occludin、Claudin-1的表达情况,阐明SB203580对紧密连接损伤的抑制作用。结果:1.CCK-8结果显示,与正常对照组相比,不同浓度(20、40、80、100、160、200μg/mL)黄花蒿花粉干预HNEpC 6 h后,细胞活力均增高(P<0.05);干预12 h后,20、40、80、100、160μg/mL组的细胞活力未见明显改变(P>0.05),200μg/mL组的细胞活力降低(P<0.05);干预24 h后,20、40μg/mL组的细胞活力未见明显改变(P>0.05),80、100、160、200μg/mL组的细胞活力降低(P<0.05)。免疫荧光染色可见,正常Occludin和Claudin-1蛋白定位于细胞膜上,表达多,围绕细胞膜形成环状结构,但Occludin和Claudin-1蛋白表达分别在200μg/mL和40、80、100、160、200μg/mL黄花蒿花粉干预时显著下降,并出现断裂、模糊,分布不均匀的现象。Western blot实验结果显示,HNEpC细胞经(100、160、200μg/mL)黄花蒿花粉干预后,p-p38MAPK表达明显增加。Western Blot和实时荧光定量PCR实验结果表明,黄花蒿花粉(40、80、100、160、200μg/mL)干预组HNEpC Claudin-1蛋白及其mRNA表达水平较对照组降低(P<0.05),而Occludin蛋白及mRNA仅在200μg/mL黄花蒿花粉处理组降低(P<0.05),其余处理组增高(P<0.05)。2.黄花蒿花粉联合SB203580干预HNEpC细胞后,免疫荧光化学染色、Western Blot、实时荧光定量PCR实验结果均显示SB203580能够抑制黄花蒿花粉引起的Occludin表达下降,而对Claudin-1蛋白表达无影响。结论:1.不同浓度黄花蒿花粉干预对鼻黏膜上皮细胞活力影响不同,紧密连接Occludin和Claudin-1的表达和分布亦有差异。高浓度黄花蒿花粉可降低HNEpC细胞紧密连接蛋白及mRNA的表达,引起上皮通透性增高,进而破坏细胞屏障功能,使得过敏原更易进入机体,这可能是黄花蒿花粉诱导过敏性鼻炎发生的重要机制之一。2.黄花蒿花粉可通过激活p38MAPK信号通路下调HNEpC细胞间紧密连接的表达,加重变应性鼻炎的发生,抑制p38MAPK信号通路可增强鼻黏膜上皮屏障功能,从细胞分子水平为黄花蒿花粉引起的气道变应性疾病的治疗提供了实验支撑。