背景:脓毒症是指机体感染微生物后发生的全身炎性反应综合征,它的并发症之一感染性休克（septic shock）是创伤、烧伤和手术后病人主要的死亡原因。统计表明,临床半数的脓毒症是由于革兰氏阴性菌（gram-negative bacteria）引起的,在革兰氏阴性菌的细胞壁上的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,或称为内毒素（endotoxin）,被认为是革兰氏阴性菌引起脓毒症的主要作用分子。脂多糖主要作用于内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞,在LPS刺激下,它们释放大量细胞因子,形成细胞因子风暴（cytokine storm）,进而引起失控性的炎症级联反应,最终造成组织损伤、内毒素休克和多器官功能障碍（mutiple organ dysfunction,MOD）等。线粒体在真核细胞中起着非常重要的作用,其主要化学成分是蛋白质和脂类,主要功能是通过氧化磷酸化合成ATP,进而为细胞生命活动提供能量。研究表明,线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类多种疾病相关,而在内毒素休克发生发展过程中,与线粒体结合的蛋白是如何调控机体的呢?相关研究甚少,而且,因为过去研究技术的限制,目前尚没有关于线粒体结合的蛋白质组学分析,这就更加限制了对这类特殊蛋白的功能研究,而近几年,飞速发展的定量蛋白质组学技术为我们的研究提供了可能。目的:通过质谱鉴定和生物信息学分析,探讨内毒素休克发展的早、中、晚期肝脏线粒体表面的结合蛋白发生的差异变化。方法:探索线粒体表面结合蛋白富集方法。差速离心法结合Nycodenz密度梯度介质法提取肝脏线粒体,然后用Western blot检测线粒体内膜标志蛋白细胞色素氧化酶Ⅳ（cytochrome c oxidases,COXIV）和外膜标志蛋白电压依赖性阴离子通道 1（voltage-dependent anion-selective channel 1,VDAC-1）表达情况,以证明提取方法的可靠性;然后分别用二硫苏糖醇（DDT）法和胰酶法富集线粒体表面的结合蛋白,做银染分析两种方法的蛋白条带。分析内毒素休克小鼠肝脏线粒体表面的结合蛋白。构建小鼠内毒素休克模型,分别用LPS处理0h、2 h、8 h、24h,提取肝脏线粒体、富集线粒体表面的结合蛋白并做银染分析,以证明蛋白在不同时期发生了差异变化且这种变化具有规律性,从而为接下来的质谱鉴定提供可靠依据;表面结合蛋白经酶解和除盐后进行质谱鉴定及生物信息学分析,包括火山图分析、聚类分析、STRING蛋白网络分析及柱状图分析。结果:首先,差速离心法结合Nycodenz密度梯度介质法提取小鼠肝脏线粒体,Western blot检测结果显示得到的线粒体呈COXIV和VDAC-1阳性,且在胞浆、匀浆总液、粗提线粒体、提纯线粒体四组分当中,灰度值依次增加;然后,银染分析DTT法和胰酶法富集得到的线粒体表面的结合蛋白,两者比较,DTT法得到的有意义的蛋白条带较多且重现性好;接着,构建内毒素休克小鼠模型,用上述验证成功的线粒体提取方法和线粒体表面结合蛋白富集方法获取结合蛋白,并做银染分析,发现蛋白表达具有差异性,为蛋白质组学分析提供了可靠的依据。最后,质谱鉴定及生物信息学分析线粒体表面的结合蛋白,鉴定出了16个差异蛋白,经过火山图分析、聚类分析、STRING蛋白网络分析及柱状图分析,可见差异蛋白的表达变化呈现一定的规律性。结论:差速离心法结合Nycodenz密度梯度介质法可获取高纯度的小鼠肝脏线粒体;DTT法富集线粒体表面的结合蛋白是有效且稳定的;内毒素休克小鼠肝脏线粒体表面的结合蛋白在不同时期的变化呈现一定规律性,且这些蛋白之间关系密切。总的来说,本研究成功富集到了线粒体表面的结合蛋白,并通过质谱鉴定和生物信息学分析,较全面地认识了早、中、晚期的内毒素休克小鼠肝脏线粒体表面的差异结合蛋白,为进一步探索内毒素休克的发生发展机制奠定了基础。