背景阴茎鳞状细胞癌（Penile squamous cell carcinoma, PSCC）占阴茎癌的绝大多数,常见于40-60岁有包皮过长或者包茎的患者,其确切病因和机制尚不完全明确。肝癌衍生生长因子（Hepatoma derived growth factor, HDGF）已被证实可作为多种类型恶性肿瘤发生、进展、预后的可靠指标,但其在PSCC中的作用仍然未有相关的研究报道。目的本研究中,我们通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）的方法检测PSCC组织中HDGF.血管内皮生长因子-A （Vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A）和Ki-67的表达,研究HDGF、VEGF-A、Ki-67表达与PSCC临床病理特征之间的关系,分析HDGF表达与、/EGF-A和Ki-67表达之间的关系,探讨HDGF以及VEGF-A和Ki-67表达在PSCC进展过程中的意义。方法2004年6月至2011年2月期间,54例PSCC患者在山东大学齐鲁医院泌尿外科接受手术治疗,术后经福尔马林固定、石蜡包埋的PSCC组织标本被纳入本次回顾性研究。对于每个PSCC石蜡标本做三个连续的厚度为4μm的组织切片,由非生物素聚合辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）免疫组织化学方法检测HDGF、VEGF-A和Ki-67的表达。PSCC组织切片经过一系列二甲苯槽脱蜡,然后通过一系列浓度梯度的酒精槽水化。此后,在微波炉中加热15分钟（Minute, min）,以10mM柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）进行抗原修复。进而由含甲醇稀释的3.0%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性,持续15min。用10%山羊血清孵育并阻断组织切片中非特异性抗原位点。随后,在4℃条件下用稀释的一抗孵育PSCC组织切片过夜,IDGF抗体应用的稀释比例为1：100,VEGF-A抗体应用的稀释比例为1：100和Ki-67抗体应用的稀释比例为1：100。一抗的检测由二抗试剂盒和DAB试剂盒完成。最后PSCC组织切片用苏木精复染,盐酸酒精分化,梯度浓度的乙醇脱水,并用甘油明胶和一个盖玻片封片。为了进一步评估HDGF、VEGF-A和Ki-67的表达,每一个组织切片随机选取超过五个独立的放大倍数400倍的视野。在不了解PSCC|临床病理资料的情况下完成PSCC组织切片HDGF、VEGF-A和Ki-67表达的免疫组织化学染色的评估。如以往报道所述HDGF和Ki-67的表达主要在细胞核区域,而VEGF-A主要积累在细胞质区域,并采用既往文献报道的方法进行评估。记录每个放大倍数400倍的视野中HDGF、VEGF-A、Ki-67表达阳性细胞的比例（阳性细胞数／该总细胞）,计算每个组织切片中HDGF、VEGF-A、Ki-67表达阳性细胞的比例,进一步分析HDGF的表达与VEGF-A、Ki-67表达之间的关系。此外分析HDGF、VEGF-A、Ki-67表达与PSCC的临床病理特征和疾病预后的相关性。统计学分析由SPSS16.0统计软件（The Statistical Package for Social Sciences version16.0, SPSS16.0）完成。应用Pearson卡方检验比较HDGF、VEGF-A、Ki-67表达与PSCC临床病理特征、PSCC患者预后的关系。将HDGF表达和病程长短转化为分类变量后,构建Logistic回归模型进一步评估其作为预后指标的意义。双尾P<0.05被认为具有统计学意义。结果免疫组织化学染色结果显示HDGF和Ki-67主要表达在细胞核,VEGF-A主要累积在细胞质中。HDGF、VEGF-A、Ki-67的表达,大于中位数被分类为高表达,而小于中位数的HDGF、VEGF-A、Ki-67表达被分类为低表达。PSCC组织切片HDGF表达免疫组织化学结果显示,28例（51.9%）PSCC患者高表达HDGF,26例（48.1%）PSCC患者低表达HDGF。而后,统计HDGF的表达与PSCC临床病理特征的关系。HDGF的表达与年龄（P=0.284）、病程长短（P=0.180）、肿瘤直径（P=0.984）、PSCC细胞类型（P=0.645）、肿瘤细胞分级（P=0.884）、淋巴结受累情况（P=0.513）和吸烟情况（P=0.150）无明显的相关性。PSCC组织切片VEGF-A表达免疫组织化学结果显示,29例（53.7%）PSCC患者高表达VEGF-A,25例（46.3%）PSCC患者低表达VEGF-A。而后,统计VEGF-A的表达与PSCC I临床病理特征的关系。VEGF-A的表达与PSCC细胞类型有统计学差异（P=0.030）,但是VEGF-A的表达与年龄（P=0.184）、病程长短（P=0.951）、肿瘤直径（P=0.816）、肿瘤细胞分级（P=0.109）、淋巴结受累情况（P=0.492）和吸烟情况（P=0.991）无明显的相关性。PSCC组织切片Ki-67表达免疫组织化学结果显示,26例（48.1%）PSCC患者高表达Ki-67,28例（51.9%）PSCC患者低表达Ki-67。而后,统计Ki-67的表达与PSCC I临床病理特征的关系。Ki-67的表达与PSCC细胞类型有统计学差异（P=0.020）。但是Ki-67的表达与年龄（P=0.266）、病程长短（P=0.761）、肿瘤直径（P=0.984）、肿瘤细胞分级（P=0.145）、淋巴结受累情况（P=0.627）和吸烟情况（P=0.422）无明显的相关性。28例高表达HDGF的PSCC患者中,19例（67.9%）PSCC患者高表达VEGF-A,9例（32.1%）PSCC患者低表达VEGF-A;26例低表达HDGF的PSCC患者中,10例（38.5%）PSCC患者高表达VEGF-A,16例（61.5%）PSCC患者低表达、/EGF-A。PSCC中,HDGF表达与VEGF-A表达密切相关（P=0.030）。28例高表达HDGF的PSCC患者中,11例（39.3%）PSCC患者高表达Ki-67,17例（60.7%）PSCC患者低表达Ki-67；26例低表达HDGF的PSCC患者中,15例（57.7%）PSCC患者高表达Ki-67,11例（42.3%）PSCC患者低表达Ki-67。PSCC中,HDGF表达与Ki-67表达无密切相关性（P=0.176）。首先,我们探讨年龄、肿瘤大小、肿瘤细胞分级、淋巴结受累情况、吸烟状况、病程长短、HDGF表达、VEGF-A表达和Ki-67表达等临床病理特征与PSCC患者的生存率之间的关联。结果发现病程大于六个月的患者的存活率比病程小于六个月的患者的存活率低（43.3%vs70.8%,P=0.043）。HDGF高表达较HDGF低表达的患者也显示出较差的生存率（39.3%vs73.1%,P=0.013）。其余的临床病理特征,如年龄（P=0.542）、肿瘤大小（P=0.625）、肿瘤细胞分级（P=0.826）、淋巴结受累情况（P=0.750）、肿瘤细胞类型（P=0.445）、吸烟状况（P=0.434）、VEGF-A （P=0.542）和Ki-67（P=0.761）的表达,与PSCC患者生存率无显著相关性。为了进一步评估和确定与PSCC生存率密切相关的临床病理特征,我们建立Logistic回归方程筛选潜在的独立预后因素OHDGF表达和PSCC病程两个与预后显著相关的因素被纳入Logistic回归。结果证实,HDGF高表达是预钡（?）PSCC患者预后的一个独立的指标（P=0.028）。结论1.HDGF的异常表达与PSCC的预后密切相关（P<0.05）。HDGF将作为一个可靠的、有应用前景的评估PSCC预后的指标和靶向治疗靶点。2. VEGF-A的表达与PSCC的细胞类型相关（P<0.05）,但与PSCC预后无显著的相关性。HDGF可调节PSCC VEGF-A的表达。3.Ki-67的表达与PSCC的细胞类型相关（P<0.05）,但与PSCC预后无明显的相关性。PSCC中,HDGF表达与Ki-67的表达无相关性。4. PSCC的病程可能为PSCC预后的一个指标。目的缺氧诱导因子-la （Hypoxia inducible factor-la, HIF1A）在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。文献报道HIF1A基因多态性可能导致各种癌症的患病风险。早期研究证实HIF1AP582S和A588T多态性存在于肾癌、尿路上皮癌和前列腺癌,但是HIF1AP582S和A588T多态性影响肾癌、尿路上皮癌和前列腺癌易感性的结论仍不一致。因此,我们进行了全面系统的荟萃分析评估HIF1AP582S和A588T多态性与泌尿系统肿瘤（Urinary Cancers, UC）易感性的关系。方法我们系统地检索PubMed在线数据库,检索探讨HIF1AP582S和A588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的病例-对照研究,时间截止到2012年11月25日,未进行语种限制设定。检索词为：（hypoxia-inducible factor-1或hypoxia-inducible factor或HIF-1或HIF1A或HIF）和（polymorphism或variant或SNP或mutation）和（kidney或renal或urothelial或transitional cell carcinoma或bladder或prostatic或prostate）。筛选标题、摘要和全文之后,11个符合纳入标准的病例-对照研究列入荟萃分析。另外人工检索研究的参考文献。我们通过一个标准的表格提取每个病例-对照研究的信息,具体包括：第一作者姓名、出版年份、进行研究的国家、种族、研究对象的性别、癌症类型、不同基因型在病例组和对照组的频率、检测HIF1A P582S和／或A588T多态性的实验方法、哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE）等。课题组通过讨论解决荟萃分析研究中的分歧。HIF1A P582S和A588T多态性各基因型和等位基因频率在高加索人和亚洲对照组人群的差异进行卡方检验。我们采用Cochrane公司开发的RevMan5.0软件评估HIF1AP582S和A588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的关系。在探讨HIF1AP582S多态性与泌尿系统肿瘤易感性的研究中,我们应用显性模型（TT+CT vs CC）,隐性模型（TT vs CT+CC）和等位基因模型（T vs C）研究二者的关系。而在探讨HIF1AA588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的研究中,由于部分病例-对照研究HIF1AA588T多态性AA基因型频率甚低,本荟萃分析未进行相关的隐性模型（AA vs AG+GG）统计,我们应用显性模型（AA+AG vs GG）和等位基因模型（A vs G）研究二者的关系。而后我们依据HWE、癌症类型和种族的不同进行亚组分析。计算荟萃分析的OR值和95%可信区间评估HDF1AP582S和A588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的相关程度。P<0.05被认为有统计学差异。异质性检验是由Q检验实现,P<0.10被认为有统计学差异。如果存在异质性（P<0.10）,荟萃分析应用随机效应模型（the Dersimonian-Laird method）;否则荟萃分析应用固定效应模型（the Mantel-Haenszel method）。敏感性分析通过排除对照组不符合HWE的病例-对照研究进行亚组荟萃分析实现,以评估荟萃分析结果的稳定性。发表偏倚由倒漏斗图评估,非对称漏斗图表明可能存在发表偏倚。漏斗图的不对称性由STATA12.1软件进行Begg’s检验评价。P<0.05被认为具有统计学差异。结果11个病例-对照研究,5195名肿瘤患者和5786名对照纳入探讨HIF1AP582S多态性与泌尿系统肿瘤易感性的荟萃分析。9个病例-对照研究,3482名肿瘤患者和4304名对照纳入探讨HIF1AA588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的荟萃分析。在探讨HIF1A P582S多态性与泌尿系统肿瘤易感性的荟萃分析中,1106名高加索人对照和1803名亚洲人对照被纳入荟萃分析。高加索人种C和T等位基因的频率分别为80.74%,19.26%；亚洲人种C和T等位基因的频率分别为95.90%和4.10%。高加索人种CC、CT和TT基因型的频率分别为69.17%,23.15%,7.69%,而亚洲人种为91.90%,7.99%和0.11%。高加索人种和亚洲人种之间HIF1AP582S多态性等位基因和基因型的频率分布明显不同（P<0.05）。我们对11项病例-对照研究的结果进行荟萃分析探讨HIF1A P582S多态性与泌尿系统肿瘤易感性的关系。荟萃分析结果表明二者之间无显著相关性,显性模型（TT+CT vs CC:OR=1.10,95%CI=0.83-1.45,Pheterogeneity=0.00,P=0.52）,隐性模型（TT vs CT+CC: OR=1.17,95%CI=0.67-2.05,Pheterogeneity=0.02,P=0.57）和等位基因模型（T vs C:OR=1.13,95%CI=0.90-1.41,Pheterogeneity=0.00,P=0.30）.我们基于种族、癌症类型、HWE状态的差异进行亚组荟萃分析。研究结果发现,高加索人种TT基因型患泌尿系统肿瘤的风险较CC或CT基因型高1.60倍（TT vs CT+CC:OR=1.60,95%CI:1.09-2.33,Pheterogeneity=0.11,P=0.02）,而其余亚组的荟萃分析结果无统计学差异（P>0.05）。在探讨HIF1A A588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的荟萃分析中,1041名高加索人对照和1800名亚洲人对照被纳入荟萃分析。高加索人种AA+AG和GG基因型的频率分别为6.72%,93.28%；亚洲人种的基因型频率分别为6.11%和93.89%；基因型分布无显著统计学差异（P>0.05）。高加索人种A和G等位基因的频率分别为3.84%和96.16%；亚洲人种的基因型频率分别为2.61%和97.39%；等位基因分布具有显著统计学差异（P<0.05）。我们基于9项病例-对照研究的数据进行了荟萃分析探讨HIF1A A588T多态性与泌尿系统肿瘤易感性的关系。荟萃分析结果表明二者之间无显著相关性,显性模型（AA+AG vs GG:OR=1.40.95%CI=0.76-2.58,Pheterogeneity=0.00,P=0.28）和等位基因模型（A vs G:OR=1.57,95%CI=0.89-2.76,Pheterogeneity=0.00,P=0.12）.基于种族、癌症类型、HWE状态的差异,我们进行亚组荟萃分析。研究结果表明A等位基因携带者患前列腺癌的风险比非A等位基因携带者高1.45倍（AA+AG vs GG:OR=1.45.95%CI=1.00-2.12,Pheterogeneity=0.50,P=0.05）；等位基因模型（A vs G:OR=1.41,95%CI=1.03-1.93,Pheterogeneity=0.22,P=0.03）,符合HWE的研究（A vs G:OR=1.45,95%CI=1.00-2.11,Pheterogeneity=0.33,P=0.05）。HIF1A A588T多态性与亚洲人种泌尿系统肿瘤易感性相关（A vs G:OR=1.46,95%CI=1.01-2.12,Pheterogeneity=0.49,P=0.04）,其余亚组荟萃分析无统计学意义（P>0.05）。显著的异质性存在于部分荟萃分析中（P<0.10）。敏感性分析通过排除对照组不符合HWE的病例-对照研究进行亚组荟萃分析实现,敏感性分析结果：HIF1A P582S多态性与高加索人种（对照组符合HWE）泌尿系统肿瘤易感性无关,隐性模型(TT vs CT+CC:OR=1.57,95%CI=0.22-11.14,P_{heterogeneity}=0.04,P=0.65)；而其余亚组荟萃分析未检测到显著性差异。通过倒漏斗图评估潜在的发表偏倚,结果表明没有明显不对称,Begg’s检验结果亦显示没有发表偏倚（P>0.05）。结论1.高加索人种与亚洲人种中,HIF1A P582S多态性基因型和等位基因分布频率具有明显差异,HIF1A A588T多态性基因型分布频率无显著差异,HIF1AA588T多态性等位基因分布频率具有明显差异。2.HIF1AP582S多态性增加高加索人种泌尿系统肿瘤易感性风险。3.HIF1AA588T多态性增加亚洲人种泌尿系统肿瘤易感性风险。4.HIFlAA588T多态性增加前列腺癌的患病风险。