甜度是苹果果实品质的主要属性之一,由可溶性糖的含量决定。苹果中可溶性糖主要包括果糖、蔗糖、葡萄糖和山梨醇。由于果糖是最甜的可溶性单糖,因此挖掘控制果糖积累的关键基因,解析果糖遗传调控机制对于改变苹果果实甜度具有重要意义。本研究以‘富士’ב金冠’F1代杂交群体为材料,利用BSA-seq与转录组的联合分析筛选出了控制果糖含量的关键基因MdNAC5。系统解析了MdNAC5通过调控液泡膜糖转运蛋白MdTST2、中性转化酶MdNINV6、以及MdEIN3.4-MdSWEET15a模块来提高果糖含量的分子机制。本研究为阐明苹果果实中果糖积累机制奠定了基础,并为苹果果实糖含量的品质改良提供了理论依据。主要研究结果如下:1、BSA-seq与转录组联合分析筛选出了调控苹果果实中果糖积累的关键候选基因MdNAC5。调查了‘富士’ב金冠’724株F1代杂交群体的糖表型性状,发现杂交后代中果糖平均含量最高,其次是蔗糖,葡萄糖,最后是山梨醇。果糖和蔗糖含量服从正态分布,为微效多基因控制的数量性状。而葡萄糖和山梨醇含量为正偏态分布。果糖,蔗糖,葡萄糖,山梨醇含量的广义遗传力在60.80%-75.06%之间。相关性分析发现果糖与葡萄糖以及山梨醇含量呈极显著正相关。挑选果糖含量最高和最低各20个杂交后代构建DNA混池,然后利用BSA-seq法进行定位,结果显示共定位到10个QTLs位点,分布于1,3,4,5,6,14,15号染色体上。进一步挑选杂交后代中果糖含量最高的三个个体和果糖含量最低的三个个体进行转录组测序,联合BSA定位结果最终在3号染色体上发现一个差异表达基因MdNAC5。它在高果糖个体‘F1-62’的果实发育期持续不断升高,而在低果糖个体‘F1-89’果实发育过程中上升缓慢。这与‘F1-62’和‘F1-89’个体果实发育期果糖积累模式相似,表明MdNAC5可能是调控苹果果实中果糖含量的关键候选基因。2、MdNAC5通过上调MdTST2和MdNINV6的表达促进果糖积累。从苹果中克隆了MdNAC5基因,系统进化树比较发现MdNAC5与Pb NAC56亲缘关系最近。瞬时过表达MdNAC5显著提高了苹果果实中果糖含量,而沉默MdNAC5降低了果实中果糖含量。在苹果愈伤组织中过表达MdNAC5同样促进了果糖积累。对苹果中单糖转运蛋白家族进行了鉴定,并利用酵母单杂交、双荧光素酶、Ch IP-PCR、EMSA等实验证明MdNAC5能结合液泡膜糖转运蛋白MdTST2启动子并促进MdTST2的表达。这些结果表明MdNAC5通过上调MdTST2的表达增加了果糖向液泡的运输。此外,还发现MdNAC5能结合胞质中性转化酶MdNINV6启动子并促进其表达,在过表达MdNAC5苹果愈伤中沉默MdNINV6后,果糖含量降低,而蔗糖含量升高,表明MdNAC5能上调MdNINV6的表达以催化蔗糖分解为果糖,从而最大程度提高果糖含量。在番茄中过表达MdNAC5也能显著增加果糖含量。RT-q PCR检测发现Sl Lin5、Slv AINV1、Sl HT3、Sl TST2、Sl SWEET2a-2和Sl SWEET12c的表达量在MdNAC5转基因番茄果实中均升高。双荧光素酶实验表明MdNAC5能直接激活Sl Lin5和Sl TST2的启动子活性。3、MdNAC5通过调控MdEIN3.4-MdSWEET15a模块促进蔗糖卸载为果糖积累提供糖源。从苹果中克隆了MdSWEET15a基因,系统进化树分析发现MdSWEET15a与梨Pu SWEET15的亲缘关系最近。亚细胞定位实验表明MdSWEET15a能够定位于烟草叶片细胞质膜上。SUSY7/ura3蔗糖转运缺陷酵母和EBY.VW4000己糖转运缺陷酵母菌株的生长互补实验表明MdSWEET15a在酵母中能转运蔗糖,而不能转运果糖和葡萄糖。原位杂交以及RT-q PCR分析发现在高果糖个体‘F1-62’的果实维管束中MdSWEET15a高表达,而在低果糖个体‘F1-89’的果实维管束中MdSWEET15a表达量较低。在苹果果实中瞬时过表达MdSWEET15a导致蔗糖含量升高,而沉默MdSWEET15a则降低了果实中蔗糖含量。这些结果表明MdSWEET15a主要在苹果果实维管束细胞中卸载蔗糖。进一步发现,在苹果果实中瞬时过表达MdEIN3.4能显著提高MdSWEET15a的表达。酵母单杂交、双荧光素酶、EMSA实验证明MdEIN3.4能直接结合MdSWEET15a启动子并激活其转录,而MdNAC5又能结合MdEIN3.4启动子并促进MdEIN3.4表达。因此在苹果中MdNAC5能调控MdEIN3.4-MdSWEET15a模块来促进果实维管束中蔗糖的卸载,为果肉细胞内果糖积累提供更多糖源。