糖尿病是常见的严重威胁人类健康和生活质量的重要的慢性疾病,仅次于心脑血管系统疾病和恶性肿瘤。患病时机体长期处于高糖环境,导致大血管、微血管受损并且危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等,糖尿病主要的并发症有糖尿病肾病,心血管系统的病变等,其在眼部的并发症主要有糖尿病性视网膜病变、与糖尿病相关的葡萄膜炎以及糖尿病性白内障等。糖尿病引发白内障是多种因素综合作用的结果,目前认为主要包括:渗透压的改变、晶状体蛋白糖基化反应、氧化损伤等。糖尿病时,由于组织细胞长期处于高血糖的环境接受高糖刺激,使得组织细胞中的活性物质生成增多,超过抗氧化物质的清除能力,氧化与抗氧化的平衡失调,产生氧化应激,氧化应激可以直接造成细胞的钙信号、凋亡和增殖改变。高脂血症是脂肪代谢或转运异常导致的血浆中一种或多种脂质高于正常值的一种全身性疾病,在诸多的流行病学调查研究中证实了高脂血症与白内障的发生有着密切的关联。低密度脂蛋白的多少是目前诊断高脂血症的主要标准,高脂血症时,机体常常出现高氧化状态,血浆中氧化型低密度脂蛋白增多,氧化型低密度脂蛋白是高脂血症患者动脉粥样硬化的最重要危险因素之一。许多研究显示高血脂可以影响细胞的钙信号、增殖和凋亡。钙离子在细胞增殖和凋亡中有重要的调节作用。Ca2+主要分布在细胞内液和细胞外液中。在细胞内,Ca2+主要储存在内质网/肌浆网中,通过内质网/肌浆网膜上的离子泵和离子通道调控其吸收和释放,从而形成精细的Ca2+浓度调控体系。在细胞内,Ca2+作为重要的第二信使对细胞产生生理病理反应具有重要意义。近年来的研究结果显示钙库操控的钙通道广泛分布于各种组织细胞,在调控细胞的生理病理功能中有重要作用,Orai和STIM是介导钙库操控的钙内流两个重要的蛋白。本研究分为以下两部分来阐明高糖和氧化型低密度脂蛋白对晶状体囊膜上皮细胞钙库操控钙内流、增殖和凋亡的影响及其机制。通过本项研究,可以明确高血糖和氧化型低密度脂蛋白对晶状体囊膜上皮细胞钙信号和增殖凋亡的作用及其分子机制,有助于了解高血糖和氧化型低密度脂蛋白在白内障发病中的可能作用和机制,为将来的治疗提供一定的理论依据,为药物筛选提供靶点,为临床治疗提供潜在的新的治疗方法。1.高糖培养对晶状体囊膜上皮细胞钙库操控钙内流、增殖和凋亡的影响钙库操控钙内流是细胞内钙库中的钙离子耗竭后激活了细胞膜上钙库操控的Ca2+通道,介导细胞外Ca2+内流。钙库操控钙内流是近年来新发现的Ca2+内流的重要方式,而且,钙库操控钙内流介导的钙信号可能是细胞内外信息交流新的重要途径,对细胞的增殖和凋亡都有重要的调节作用。本研究采用高糖培养晶状体囊膜上皮细胞株HLEpi C细胞模拟体内的高血糖环境,检测了高糖培养对HLEpi C细胞钙库操控钙内流和增殖凋亡的影响。结果发现:(1)糖尿病白内障患者的晶状体囊膜上皮细胞Orai1的表达显著增多;(2)钙成像实验发现高糖培养1、3、7、14天后,三磷酸腺苷(ATP)和钙库上的钙泵抑制剂毒胡萝卜素(TG)介导的钙库操纵的钙内流都显著增强;(3)免疫蛋白印迹结果显示,高糖培养的HLEpi C细胞STIM1、Orai3显著升高,Orai2没有显著改变,而Orai1出现明显降低;(4)Orai1和STIM1 si RNA显著抑制了HLEpi C细胞Orai1和STIM1蛋白的表达,同时也显著抑制了TG介导的钙库操纵的钙内流;(5)高糖培养7天后HLEpi C细胞的增殖和凋亡都显著增强。这些结果表明高糖培养引起的增强的钙库操控钙内流可能是由于高糖环境诱发HLEpi C细胞表达更多的介导钙库操控钙内流相关蛋白造成,高糖培养导致的增强的钙库操控钙内流可能是引起HLEpi C细胞增殖和凋亡增强的一个重要原因。2.氧化型低密度脂蛋白对晶状体囊膜上皮细胞钙库操控钙内流、增殖和凋亡的影响氧化型低密度脂蛋白也可以影响细胞的钙信号、增殖和凋亡。本研究采用硫酸铜氧化低密度脂蛋白制备氧化型低密度脂蛋白,然后根据文献使用100μg/ml氧化型低密度脂蛋白处理HLEpi C细胞24h,检测HLEpi C细胞的钙库操控钙内流、增殖和凋亡。通过实验发现:(1)TG介导的钙库操控钙内流明显增强;(2)免疫蛋白印迹显示,氧化型低密度脂蛋白处理的晶状体囊膜上皮细胞Orai3和STIM1蛋白表达显著升高,而Orai1和Orai2表达却没有显著改变;(3)CCK8细胞增殖结果显示,氧化型低密度脂蛋白处理的细胞增殖明显增强;(4)TUNEL实验结果也显示,氧化低密度脂蛋白处理的HLEpi C细胞凋亡显著增强。这些结果说明氧化型低密度脂蛋白可以导致HLEpi C细胞表达钙库操控钙内流相关蛋白增强,从而引起钙库操控钙内流增强,而且钙库操控钙内流增强可能是引起HLEpi C细胞增殖和凋亡增强的原因之一。