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背景和目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重的慢性微血管并发症之一,是导致终末期肾衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的主要病因,如何早期有效防治DN已成为当今国内外学者密切关注的课题。DN的发病机制非常复杂,晚近研究认为除代谢与血流动力学紊乱外,以巨噬细胞激活介导的肾内炎症在DN发生、发展中起重要作用,但糖尿病肾内巨噬细胞激活的信号传导通路尚不清楚。转化生长因子β激活激酶1(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的成员之一,在功能上位于丝裂原蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶的上游。近来研究表明TAK1可以被多种刺激因素激活并活化MAPK通路,且活化的TAK1可磷酸化并激活NIK(NF-κB induced kinase),最后激活核转录因子(NF-κB),在细胞的生长、分化、凋亡以及控制各种基因如炎症因子、细胞粘附分子及生长因子等表达中发挥重要的作用。本研究采用TAK1抑制剂(5Z-7-oxozeaenol,OZ)分别作用于糖尿病db/db小鼠和小鼠巨噬细胞,从整体、细胞和分子水平系统观察TAK1信号通路、炎症因子、趋化因子(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、黏附因子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)变化,探讨TAK1参与早期DN发生的作用机制。从基因或蛋白水平阻断TAK1致病作用的有效途径,进一步阐明DN发病的分子学机制并为其防治提供新思路。第一部分:健康雄性小鼠36只,选取同窝野生型小鼠(wild type,WT)12只作为正常对照组(WT,n=12),db/db小鼠(db/db,n=12)和db/db小鼠+抑制剂组(db/db+OZ,n=12)。其中db/db小鼠尾尖取血血糖仪测定血糖,血糖≥16.7mmol/L者确定为模型。于用药第8,12周末收集各组小鼠血、尿和肾组织标本,测定血糖、体重、肾重以及24h尿白蛋白排泄率;光镜、电镜观察肾组织病理改变;免疫组化检测ED-1,NF-κB p65,MCP-1以及TNF-α;western blot检测肾组织p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK以及IL-1β蛋白的表达;实时定量PCR检测趋化因子ICAM-1,MCP-1m RNA的表达。方法:第二部分:取小鼠巨噬细胞种植于96孔板,采用CCK-8法分别检测干预药物TAK1抑制剂在不同药物浓度对高糖、AGEs培养巨噬细胞活力的影响。采用6孔板培养细胞,将细胞分组:甘露醇对照组(MN),牛血清白蛋白组(BSA),正常对照组(NC),高糖组(HG),AGEs组(AGEs),高糖+TAK1抑制剂组(HG+OZ30,100,300n M),AGEs+TAK1抑制剂组(AGEs+OZ30,100,300n M),于刺激的相应时间点收集细胞。流式细胞术检测高糖、AGEs刺激因素对骨髓来源巨噬细胞的激活作用;提取细胞m RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR检测各组细胞中促炎细胞因MCP-1以及TNF-αm RNA的表达;Western blot检测各组总蛋白中p-TAK1,TAB1,p-JNK,p-p38MAPK,NF-κB p65,IL-1β蛋白的表达。结果:第一部分:①与对照组相比,8-12周db/db小鼠血糖、体重、肾重及24h尿白蛋白排泄率均明显升高(P<0.01);db/db+OZ组小鼠体重、肾重及24h尿白蛋白排泄率改变较db/db小鼠显著减轻(P<0.05,P<0.01)。②8-12周时,光镜观察db/db小鼠肾小球体积增大、系膜细胞增多、基底膜增厚以及细胞外基质增多,电镜观察db/db小鼠肾小球基底膜局部隆起不规则增厚,足细胞足突融合;db/db+OZ组肾组织的病理改变则明显得到改善(P<0.05)。③免疫组化结果显示,8-12周db/db小鼠较对照组ED-1,NF-κB p65,MCP-1和TNF-α蛋白的表达明显上调(P<0.05);db/db+OZ组与db/db组相比,ED-1,NF-κB p65,MCP-1和TNF-α蛋白的表达则明显降低(P<0.05)。④Western blot结果显示,8-12周db/db小鼠较对照组p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表达明显上调(P<0.05);db/db+OZ组与db/db组相比,p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表达则明显下降(P<0.05);非磷酸化TAK1,p38MAPK在各组的表达均无明显差异(P>0.05)。⑤实时定量PCR结果显示,db/db小鼠较对照组小鼠趋化因子ICAM-1,MCP-1 m RNA表达明显增加(P<0.01);db/db+OZ组与db/db组相比,ICAM-1,MCP-1 m RNA表达则明显抑制(P<0.05,P<0.01)。第二部分:①与正常对照相比,10,30,100和300 nmol/L抑制剂对HG,AGEs培养的骨髓来源巨噬细胞活力无明显影响(P>0.05),1000nmol/L抑制剂对巨噬细胞活力有影响(P<0.05)。②实时定量PCR检测结果显示,与NC组相比,HG,AGEs组细胞MCP-1,TNF-αm RNA的表达明显上调(P<0.01);抑制剂组与HG,AGEs相比,MCP-1,TNF-αm RNA的表达则明显下调(P<0.05,P<0.01)。③流式细胞术检测HG,AGEs刺激因素可成功诱导骨髓来源巨噬细胞功能表型向M1型巨噬细胞活化;抑制剂干预使M1型巨噬细胞表面标记物表达百分比明显降低(P<0.05,P<0.01)。④Western blot结果显示p-TAK1,TAB1,p-JNK,p-p38MAPK,NF-κB p65和IL-1β蛋白在HG、AGEs组的表达强于NC(P<0.05)组;但抑制剂组蛋白表达明显弱于HG,AGEs组(P<0.05)。TAK1,JNK,p38MAPK在各组的表达无明显变化(P>0.05)。结论:1体内实验初步证实,糖尿病状态下p-TAK1在肾脏表达增强,伴有肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质积聚、巨噬细胞活化等肾脏炎症病理改变,提示p-TAK1在糖尿病肾病发生机制中可能起一定作用。2 db/db小鼠肾组织p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK和NF-κB p65的表达上调及ICAM-1,MCP-1,TNF-α,IL-1β的合成增加,TAK1抑制剂可以下调MAPK,NF-κB信号通路以及炎症因子的表达,提示TAK1促发糖尿病肾病发生的机制可能与MAPK以及NF-κB信号通路激活有关,但具体作用途径有待进一步研究阐明。3高糖、晚期糖基化产物环境下,骨髓来源巨噬细胞活化,细胞内TAK1,MAPK和NF-κB信号传导通路表达上调,高表达IL-1β,MCP-1,TNF-α;TAK1抑制剂抑制MAPK以及NF-κB信号通路激活,下调巨噬细胞炎症因子的表达。