前言砷是一种自然环境中广泛存在的类金属元素,以有机胂和无机砷两种形式存在,而无机砷的毒性较有机胂强。人类可以通过环境、职业暴露或者使用含砷药物而接触到无机砷(iAs),而环境砷暴露主要通过饮用自然界中被砷污染的水源。全世界约有2亿人正处于慢性饮水型高砷暴露的威胁中,我国大陆地区饮水型砷中毒病区中的高砷暴露人群已接近300万,随着调查的深入,慢性饮水型高砷暴露人群的数目正在不断扩大。慢性饮水型砷暴露不仅能够引起砷性皮肤损伤,砷性皮肤癌及其它内脏器官肿瘤,还与心血管疾病、高血压和糖尿病等常见疾病的发生关系密切。2型糖尿病(T2D)已经成为一个全球性的公共卫生问题。截至到2000年全球有大约1.5亿人患有2型糖尿病,预计到2025年将有3亿人会罹患2型糖尿病。遗传和不良生活方式等因素都与糖尿病的发病有关。而环境危险因素暴露与糖尿病发生也存在一定程度的联系,目前还未得到医学界的广泛关注。环境砷暴露和2型糖尿病的因果关系还不明确,但对台湾、孟加拉、瑞典和墨西哥等砷暴露人群的流行病学调查研究显示环境砷暴露与糖尿病的发生关系密切。最近,Meliker等对美国密歇根州饮用水中无机砷为0.011 ppm的居民进行的研究中发现低砷暴露和2型糖尿病发生存在显著相关性。另外一项对美国788位成年人的横断面调查研究显示低砷暴露与2型糖尿病的流行存在明显的正相关。这些近期的流行病学研究也都说明砷污染是暴露人群的2型糖尿病发生的重要因素之一。2型糖尿病的发生是胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗共同作用的结果。胰岛β细胞具有对葡萄糖刺激反应释放胰岛素的功能,即葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能,而胰岛细胞GSIS功能的降低是2型糖尿病发生的原因之一。根据目前的研究,β细胞的GSIS过程受细胞内葡萄糖代谢的直接影响,即从最初的葡萄糖摄入和磷酸化,胞质和线粒体内的糖代谢,及随后产生的信号,最终导致胰岛素分泌。目前认为葡萄糖糖酵解和氧化磷酸化过程引起的ATP/ADP比值的变化是β细胞信号转导中的关键信号,但葡萄糖代谢和胰岛素分泌偶联的确切信号目前还不十分清楚。前期研究发现活性氧(ROS),如糖代谢过程中产生的过氧化氢(H2O2),可以作为信号参与GSIS过程。因此,氧化应激诱导的内源性抗氧化酶的升高很可能拮抗葡萄糖引起的ROS信号,从而抑制GSIS功能。以往的研究表明,砷暴露能够诱导机体和细胞处于氧化应激状态,同时活化核转录因子-E2类相关因子2(Nrf2),而Nrf2作为细胞内抵御氧化损伤的关键蛋白调节许多结构型和诱导型抗氧化酶和解毒酶的表达。Nrf2调节多种内源性抗氧化酶,如：血红素氧化酶1 (Hmox1), NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (NQO1),过氧化氢酶(CAT),γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(Gclc)和调节亚基(Gclm)和硫氧还蛋白1 (Srxn1),维持细胞内氧化还原状态,保护细胞免受氧化损伤,但是这种内源性抗氧化酶的升高还存在一种潜在的副作用,就是降低细胞内ROS作为第二信使的功能。本研究拟通过对胰岛β细胞系INS-1(832／13)的细胞试验研究,首先探讨砷暴露对β细胞GSIS功能、细胞活力、胰岛素含量及胰岛素基因表达的影响。其次,通过测定低剂量亚砷酸钠暴露引起的氧化应激水平和细胞的内源性抗氧化水平,研究核转录因子Nrf2在调节胰岛β细胞GSIS功能中的作用。最后,研究同样条件下的砷暴露对胰岛β细胞经典GSIS过程中各环节的影响,进一步探讨砷暴露对胰岛β细胞GSIS功能影响的机制。材料与方法1、细胞培养,砷处理和质粒转染：INS-1(832／13)细胞常规培养于RPMI 1640培养液中,培养液含10%胎牛血清(FBS),10mM葡萄糖,25mMHEPES,50μMβ-巯基乙醇,100 U／ml青霉素,100μg／ml链霉素,37℃,5%的二氧化碳培养箱中。细胞染毒：INS-1(832／13)细胞亚砷酸钠(0,0.05,0.1,0.25,0.5 gM)染毒96 h,每48 h重新换含砷培养液继续培养。Nrf2质粒转染应用Lipofectamine 2000试剂完成。2、胰岛素测定：采用放射免疫测定试剂盒法测定,应用大鼠胰岛素作为标准标定样品浓度,结果用细胞的DNA含量校正。3、抗氧化反应元件报告基因活性检测：INS-1(832／13)细胞转导含ARE报告基因的病毒颗粒后,应用0.35μg/ml puromycin的选择培养基筛选细胞为稳定细胞系。荧光素酶的活性测定采用双荧光素酶报告基因检测系统,按照试剂盒说明书操作。荧光素酶活性用细胞活力校正。细胞活力测定采用非放射性细胞增殖检测试剂盒测定。4、细胞内过氧化氢的测定：细胞内过氧化氢应用CM-H2DCFDA探针标记,应用流式细胞仪测定荧光强度。5、细胞内谷胱甘肽浓度的测定：砷处理后的细胞用预冷的PBS冲洗三次后收集细胞,超声破碎细胞,12000 g,4℃离心5 min,上清用于氧化型和总谷胱甘肽的测定。总谷胱甘肽浓度和氧化型谷胱甘肽的测定按照BIOXYTECH GSH/GSSG-412试剂盒说明书进行。6、过氧化氢清除能力的测定：砷处理后细胞的上清液中剩余的过氧化氢浓度测定应用Amplex Red过氧化氢检测试剂盒测定,细胞上清液中的过氧化氢浓度之差反映细胞的过氧化氢清除能力。上清液中蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白检测试剂盒标定,牛血清白蛋白作为标准。7、实时定量RT-PCR分析基因表达：TRIzol法抽提细胞总RNA,经无RNA酶的DNA酶处理和RNeasy Mini试剂盒纯化。实时荧光检测使用ABI PRISM 7900 Sequence Detector检测。8、Western Blot免疫印迹检测蛋白表达：细胞总蛋白和细胞核组分的分离和Western Blot用于检测Nrf2、GCK, Glut2、KIR6.2、SUR1、LaminA、β-actin蛋白表达水平。9、细胞内ATP含量的测定：砷处理结束的细胞用预冷的Kreb’s缓冲液冲洗,加入ATP释放缓冲液,超声裂解,12000 g,4℃离心5 min,上清液立即用于测定。ATP水平的测定使用ATP生物发光检测试剂盒,结果由蛋白浓度校正。10、细胞内线粒体含量测定：细胞内线粒体应用绿色荧光探针MitoTracker Green标记,采用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测。探针的应用浓度为75 nM,预染时间为30 min。在流式细胞仪测定过程中,死细胞和细胞团通过前向散射与侧散射被淘汰,未经处理的细胞作为对照。11、细胞耗氧率(OCR)的测定：OCR测定应用XF24 Extracellular Flux分析仪,基础耗氧率和葡萄刺激的OCR变化连续3-5 min测定缓冲液中氧分压,计算细胞耗氧率。结果1、亚砷酸钠对胰岛p细胞GSIS功能的影响INS-1(832／13)细胞砷暴露96 h后,高剂量(>0.5μM)砷处理导致细胞活力下降,当砷浓度高于1μM时观察到明显的细胞毒性。INS-1(832／13)细胞暴露在非毒性剂量(<0.5μM)的亚砷酸钠,葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少,并且这种减少与砷暴露浓度存在剂量效应关系。相对于GSIS功能降低,砷处理却使细胞基础胰岛素分泌(3 mM葡萄糖)增加。慢性低砷暴露升高细胞胰岛素基因表达和细胞内胰岛素含量。2、亚砷酸钠对胰岛p细胞Nrf2介导的抗氧化反应及Nrf2对GSIS功能的影响低剂量亚砷酸钠暴露使细胞核蛋白Nrf2水平升高、抗氧化反应元件(ARE)-荧光素酶活性升高、Nrf2的下游靶基因的表达升高、细胞内谷胱甘肽浓度升高。低砷暴露使细胞内过氧化氢的清除能力升高,而且与砷暴露浓度存在剂量依赖性。亚砷酸钠使细胞内基础的过氧化物水平升高,却明显抑制葡萄糖刺激的细胞内过氧化物生成百分率,这与砷暴露导致的胰岛细胞的GSIS功能降低相关。Nrf2的激活剂SFN或Nrf2质粒的转染影响胰岛p细胞GSIS功能,验证了Nrf2介导的抗氧化反应在调节GSIS功能中的作用。3、亚砷酸钠对胰岛β细胞经典GSIS途径的影响亚砷酸钠对经典GSIS通路中Glut2、GCK, Kcnj11、SUR1等关键基因和蛋白的表达未见影响；测定低砷暴露细胞在低糖和高糖条件下的ATP水平,没有观察到砷暴露细胞的葡萄糖刺激ATP生成的变化；与GSIS功能显著降低相比,砷暴露却升高细胞内线粒体含量。对经典GSIS途径中各环节的研究表明砷暴露所引起的INS-1(832／13)细胞GSIS功能降低不是由于砷影响GSIS过程的经典途径。结论1、在未发现明显细胞毒性的低剂量砷暴露96 h刺激基础胰岛素分泌的同时,降低高糖刺激的胰岛素分泌,降低β细胞对葡萄糖的反应性。2、亚砷酸钠暴露激活Nrf2介导的抗氧化反应,这种升高的抗氧化反应拮抗作为信号的ROS,从而影响细胞GSIS功能。Nrf2激活剂SFN处理或过表达Nrf2抑制β细胞的GSIS功能,进一步验证了砷引起的Nrf2活化在调节胰岛β细胞GSIS功能中的作用。3、亚砷酸钠对经典GSIS通路中Glut2、GCK、Kcnj11、Surl的基因和蛋白表达没有影响。未观察到细胞的葡萄糖刺激ATP生成的变化,提示低剂量亚砷酸钠引起的胰岛β细胞GSIS功能抑制不是因为砷对经典GSIS途径的影响。