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第一部分PM2.5对接触香烟烟雾的小鼠肺部炎症或接触香烟烟雾提取物的人支气管上皮细胞炎症反应的影响目的:大气细颗粒物PM2.5和香烟烟雾是慢性阻塞性肺病(COPD)的常见致病因素,并且与肺部炎症有关。本部分实验的研究目的旨在探究小鼠和细胞模型中,PM2.5对香烟烟雾/香烟烟雾提取物(CSE)所致COPD炎症反应的影响。方法:将32只健康雄性C57BL/6小鼠(18-21g,6-8周龄)随机分为4组:空气对照组、PM2.5组、香烟(香烟烟雾暴露法)组、PM2.5+香烟组(n=8/组)。苏木精-伊红(H&E)染色评估每组小鼠肺组织的病理学变化。双重免疫荧光染色观察小鼠肺组织气道周围炎症细胞的浸润情况。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠肺组织炎症基因(IL-6和IL-8)的mRNA水平。另一方面,首先用不同浓度的PM2.5和不同浓度的CSE刺激16HBE细胞24 h,然后用恒定浓度的PM2.5和CSE刺激16HBE细胞不同的时间段。通过ELISA测定细胞培养基上清中炎症因子(IL-6和IL-8)的蛋白水平,以确定合适的PM2.5浓度、CSE浓度及其刺激时间。根据研究目的,将16HBE细胞分为以下4组:正常对照组、PM2.5组、CSE组、PM2.5+CSE组,细胞接受相应PM2.5/CSE刺激24h。ELISA测定16HBE细胞培养上清液中IL-6和IL-8的蛋白水平;qRT-PCR检测16HBE细胞内IL-6和IL-8的mRNA水平。结果:小鼠模型中,H&E染色显示PM2.5组和香烟组中,小鼠肺组织气道周围炎症细胞明显浸润,肺泡壁变薄,肺泡融合和肺泡腔扩大;PM2.5+香烟组中肺组织的病理学变化更为显著。双重免疫荧光显色显示PM2.5组和香烟组小鼠肺组织中性粒细胞和淋巴细胞浸润增加,该现象在PM2.5+香烟组中更加明显。qRT-PCR结果显示PM2.5组和香烟组小鼠肺组织IL-6和IL-8的mRNA水平升高;PM2.5+香烟组中的炎症因子mRNA水平升高更加明显,且明显高于PM2.5组和香烟组。细胞模型中,100 ug/ml被选择作为PM2.5最佳刺激浓度,10%被选择作为CSE的最佳刺激浓度,最佳刺激时间为24 h。PM2.5组和CSE组16HBE细胞培养上清液中IL-6和IL-8蛋白水平与正常对照组相比升高;PM2.5+CSE组中炎症因子水平升高更加明显,且均明显高于PM2.5组和CSE组。各组细胞中qRT-PCR的检测结果与ELISA结果一致。结论:在香烟烟雾或CSE所诱导的COPD模型中,PM2.5能够增强小鼠肺组织、16HBE细胞内已经存在的炎症反应。第二部分PM2.5、香烟烟雾/香烟烟雾提取物诱导气道炎症反应过程中Wnt5a表达水平的变化目的:本部分实验的研究目的旨在观察PM2.5、香烟烟雾/香烟烟雾提取物(CSE)诱导气道炎症反应过程中Wnt5a表达水平的改变。方法:将32只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:空气对照组、PM2.5组、香烟(香烟烟雾暴露法)组、PM2.5+香烟组(8只/组),每组小鼠接受相应的的刺激暴露。根据研究目的,将16HBE细胞分为以下4组:正常对照组、PM2.5组、CSE组、PM2.5+CSE组,并接受PM2.5/CSE刺激24 h。qRT-PCR检测小鼠肺组织和16HBE细胞内Wnt5a的mRNA水平;免疫荧光观察各组小鼠肺组织中Wnt5a的荧光强度;Western Blot检测16HBE细胞中Wnt5a的蛋白水平变化。结果:在小鼠模型中,免疫荧光结果显示PM2.5对照组和香烟组的肺组织中Wnt5a的荧光强度显著增强,PM2.5+香烟组中Wnt5a的荧光强度增加更加明显,且分别高于PM2.5组和香烟组;小鼠肺组织中Wnt5a的mRNA水平与Wnt5a免疫荧光的趋势一致。在细胞模型中,PM2.5组和CSE组中Wnt5a的mRNA和蛋白质水平较正常对照组增加,PM2.5+CSE组中的Wnt5a水平增加更加明显。结论:PM2.5、香烟烟雾/CSE诱导气道炎症反应过程中,小鼠肺组织或16HBE细胞内Wnt5a的表达水平是增加的。第三部分Wnt5a特异性拮抗剂BOX5的应用可改善人支气管上皮细胞中PM2 5和香烟烟雾提取物诱导的炎症反应目的:本部分实验的目的旨在观察BOX5(一种Wnt5a的特异性拮抗剂)的应用是否可通过部分抑制Wnt5a的表达,减弱PM2.5和CSE刺激条件下16HBE细胞中炎症反应的发生,并探究Wnt5a与胞外信号调节激酶(extracellular signal-related kinase,ERK)信号通路的关系。方法:根据研究目的,将32只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:空气对照组、PM2.5组、香烟组、PM2.5+香烟组(n=8/组)。Western Blot检测小鼠肺组织中ERK信号通路相关蛋白P-ERK1/2和T-ERK1/2的表达水平。16HBE细胞按接受刺激条件的不同分为以下4组:正常对照组、PM2.5组、CSE组、PM2.5+CSE组。细胞接受相应刺激24 h后,Western Blot检测16HBE细胞中ERK信号通路相关蛋白P-ERK1/2、T-ERK1/2的水平变化。明确小鼠和细胞模型中ERK信号通路的活性后,用Wnt5a的特异性拮抗剂BOX5(200 uM)或PBS预孵育16HBE细胞1 h,随后,给予相应的PM2.5或CSE刺激。ELISA检测16HBE细胞培养上清液中IL-6和IL-8的蛋白水平;qRT-PCR检测16HBE细胞内IL-6和IL-8的mRNA水平;Western Blot检测16HBE细胞中ERK信号通路相关蛋白P-ERK1/2、T-ERK1/2和Wnt5a的水平变化以探究Wnt5a-ERK信号通路在PM2.5、CSE引起的气道炎症效应中发挥的作用。结果:在小鼠模型中,PM2.5组和香烟组小鼠肺组织中ERK信号通路相关蛋白(P-ERK1/2、T-ERK1/2)的表达水平与空气对照组相比增高。而且,PM2.5+香烟组中P-ERK1/2水平及其与T-ERK1/2的比值增加更加明显,与PM2.5组和香烟组的结果相比仍有明显统计学差异。在细胞模型中,PM2.5组和CSE组16HBE细胞中ERK信号通路相关蛋白(P-ERK1/2、T-ERK1/2)表达水平较正常对照组增高。而且,PM2.5+CSE组中P-ERK1/2水平及其与T-ERK1/2的比值增加更加明显,与CSE组的结果相比存在显著的统计学差异。Wnt5a特异性拮抗剂BOX5的应用可明显减轻16HBE细胞中PM2.5和CSE诱导的IL-6、IL-8以及Wnt5a水平的上调,同时下调相应组中P-ERK1/2的蛋白表达水平和P-ERK1/2与T-ERK1/2的比值。结论:Wnt5a可能通过ERK信号通路参与调控PM2.5、香烟烟雾/CSE诱导的气道炎症反应。