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肝癌是世界最常见的恶性肿瘤之一,肝癌引起的死亡人数占到了世界癌症死亡人口的三分之一,是我国第二大癌症死亡原因。目前,我国肝癌发病率出现逐年上升趋势,带来沉重的社会、医疗和家庭负担。肝癌目前主要的治疗方式有手术切除,肝移植,介入治疗,以及放化疗。由于近年分子靶向药物在肝癌中的应用,肝癌患者的预后有了一定程度的改善,但仍需要寻找更有效的肝癌发生发展过程中的关键靶点分子。由于肝癌恶性程度高,进展迅速,往往发现较晚,造成肿瘤死亡率很高,在肝癌中通过对肝癌发生发展过程中分子调控机制的研究,找到特异性的肝癌治疗位点,并针对该治疗位点开发肝癌药物,在肝癌治疗中具有重要的意义。凋亡抑制蛋白c-FLIP(cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme inhibitory protein)是1997报道发现的IAP家族中的一个重要成员,是一类含有死亡效应结构域的凋亡抑制蛋白,在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在,与炎症、肿瘤及自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。在肿瘤细胞中,c-FLIP在细胞外凋亡通路,NF-κB通路,以及自噬和坏死通路中发挥重要的功能,有证据显示,c-FLIP对很多蛋白泛素化过程具有调节作用。c-FLIP是在肝癌细胞中促进肿瘤的增殖,在肝癌组织的中的表达较癌旁组织中高,与肝癌的预后具有负相关性。肿瘤的恶性增殖离不开能量物质的供给和代谢失常,c-FLIP与肝癌细胞能量代谢是否相关,目前还未见报道。葡萄糖作为细胞的主要能源物质,在肿瘤增殖过程中发挥重要的作用,研究发现,肿瘤细胞的葡萄糖代谢与正常组织的葡萄糖代谢是不同的。在肿瘤细胞中,葡萄糖主要通过有氧酵解的方式进行代谢,产生大量的乳酸。在肿瘤细胞中,葡萄糖的摄取明显高于正常组织,肿瘤细胞通过过表达葡萄糖转运体来满足自身的葡萄糖需求。在不同的肿瘤细胞,表达不同的葡萄糖转运体。肿瘤葡萄糖代谢的改变主要依赖于细胞中各种癌基因和抑癌基因的共同作用来实现的。c-FLIP在肝癌中作为一种促进肿瘤增殖的分子,是否对肿瘤的葡萄糖代谢具有影响呢?影响机制是什么?本课题针对上述问题进行了深入的探讨和研究。目的明确c-FLIP对肝癌细胞葡萄糖代谢是否具有影响;阐明c-FLIP调控细胞葡萄糖代谢的机制;分析c-FLIP调控肝癌细胞葡萄糖代谢在肝癌发生发展中意义,以及与肝癌的临床预后的相关性。方法1.将c-FLIPL干涉慢病毒感染细胞,构建c-FLIPL特异性干涉的稳转细胞;用能量实时检测仪seahorse XF24 Analyer分析c-FLIPL对肝癌细胞葡萄糖代谢的影响;在细胞培养基中使用荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG,流式细胞仪分析细胞葡萄糖摄取能力,构建小鼠肝癌荷瘤模型,并利用小动物PET-CT分析机体肿瘤葡萄糖摄取能力,同时在肝癌荷瘤模型中分析c-FLIPL对肝癌增殖的影响。2.通过Western Blot和RT-PCR在蛋白和RNA水平分析c-FLIPL对葡萄糖转运体的影响;通过蛋白质泛素化检测方法检测c-FLIPL对葡萄糖转运体泛素化降解影响;使用免疫共沉淀和间接免疫荧光实验检测蛋白质间的相互作用。3.流式细胞仪检测肝癌细胞在低糖条件下细胞的凋亡水平;筛选出对低糖敏感的肝癌细胞系;分析c-FLIPL对低糖耐受的影响。4.利用免疫组化技术测定肝癌及癌旁组织中c-FLIPL及其调控的葡萄糖转运体的表达;分析在肝癌中和癌旁组织中的表达是否具有差异,二者之间的表达是否具有相关性;统计分析其表达与肝癌临床分期的相关性。结果1.c-FLIPL促进肝癌细胞糖酵解,同时在细胞水平和动物模型中发现c-FLIPL通过促进细胞葡萄糖的摄取进而促进肝癌细胞有氧酵解。我们还发现,在肝癌荷瘤裸鼠动物模型中,c-FLIPL促进肿瘤的增殖。2.在肝癌细胞中,我们发现c-FLIPL影响细胞葡萄糖摄取是通过与SGLT1相互作用,抑制肝癌细胞中SGLT1蛋白泛素化,抑制SGLT1降解,促进肝癌细胞通过SGLT1主动摄取葡萄糖。3.不同的肝癌细胞系对低糖的敏感性不同,在肝癌细胞系Hep G2,MHC-97h,Huh-7,SMMC-7721,BEL-7704中,Hep G2,MHC-97h,Huh-7对低糖耐受,SMMC-7721,BEL-7704对低糖敏感,在对低糖耐受的细胞中,SGLT1的表达较敏感细胞表达高。提示SGLT1对细胞低糖耐受起重要的作用,进一步研究发现c-FLIPL通过影响SGLT1促进细胞对低糖的耐受。4.我们通过免疫组化检测c-FLIPL和SGLT1在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平,发现c-FLIPL和SGLT1在在肝癌组织中的表达均显著高于癌旁组织,统计分析发现c-FLIPL的表达与SGLT1的表达具有正相关性。同时发现,在肝癌中c-FLIPL和SGLT1的表达与肝癌的临床分期具有正相关性。结论本课题研究发现c-FLIPL通过抑制肝癌细胞葡萄糖主动转运体SGLT1的降解,促进细胞葡萄糖摄取吸收,促进肝癌细胞对低糖的耐受。在肝癌组织中c-FLIPL与SGLT1表达高于癌旁组织,且二者表达具有相关性,与肝癌的临床分期正相关,明确了c-FLIPL在肝癌葡萄糖代谢的调控作用,及SGLT1在肝癌发展中的意义。