研究背景：胶质瘤(glioma)是发生于神经外胚层的肿瘤,故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤,其发病率占颅脑肿瘤的40-50%。大多数胶质瘤起源于不同类型的神经胶质细胞,但由于组织发生来源及生物学特征类似,一般都称为神经胶质瘤。胶质瘤的分类方法很多,各型胶质瘤中,以星形细胞瘤最多,胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤次之[1]。各型胶质瘤的好发部位不同,如胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球,髓母细胞瘤发生于小脑蚓部,室管膜瘤多见于第4脑室,少突胶质瘤大多发生于大脑半球,星形细胞瘤在成人中多见于大脑半球,而儿童中则多发生于小脑。胶质瘤以男性较多见,特别在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤,男性明显多于女性。各型胶质母细胞瘤多见于中年人,室管膜瘤多见于儿童及青年,髓母细胞瘤几乎都发生在儿童。胶质瘤的部位与年龄也有一定关系,如大脑星形细胞瘤和胶质母细胞瘤多见于成人,小脑胶质瘤(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤)多见于儿童[2]。胶质瘤大多缓慢发病,自出现症状至就诊时间一般为数周至数月,少数可达数年。恶性程度高肿瘤患者病史较短,良性肿瘤患者病史较长。肿瘤若有出血或囊变,症状会突然加重,甚至有类似脑血管病的发病过程。胶质瘤的临床症状可分两方面,一方面是颅内压增高症状,如：头痛、呕吐、视力减退、复视、精神症状等；另一方面是肿瘤压迫、浸润、破坏脑组织所产生的局灶症状,早期可表现为刺激症状,如局限性癫痫,后期表现为神经功能缺失症状,如瘫痪。炎症反应(inflammatory reaction)指生物组织受到外伤、出血或病原感染等刺激,激发的生理反应。其中,包括红肿、发热、疼痛等症状。炎性反应是先天免疫系统为移除有害刺激或病源体及促进修复的保护措施,并非如后天免疫系统般针对特定病源体[3]。炎症反应并非等同于感染,即使很多时候炎症的发生是因感染而引起,但通常情况下,炎症是生物体对病源体之反应之一,是有益的,是人体的自主防御反应；然而,有时候炎症可以引起人体自身免疫系统的过敏,进而攻击自身的组织及细胞。炎症反应是机体用于对抗感染、组织损伤等有害刺激的一种重要防御机制,但是在很多情况下过度的炎症本身就会对机体造成损害。炎症反应的发生刺激中性粒细胞和巨噬细胞吞噬病原菌以及坏死崩解的细胞碎屑,同时巨噬细胞(macrophage)在机体的非特异免疫功能中发挥着重要的作用。有研究表明在肿瘤发生初期,来自健康组织的巨噬细胞活化后可以抑制肿瘤细胞的生长,但是在肿瘤恶化阶段,来自瘤体内部的巨噬细胞却促进肿瘤细胞的生长。巨噬细胞在肿瘤发生的不同阶段扮演着不同的角色。研究发现,肿瘤组织中巨噬细胞的高度浸润与肿瘤患者的预后相关。有研究表明,化疗或者放疗成功抑制瘤体生长3个月后,患者的瘤体局部有活动性炎症出现,浸润细胞有活化的巨噬细胞和星形胶质细胞、CD3+和CD8+的淋巴细胞,并继发脱髓鞘的改变[4]。可见巨噬细胞介导的炎症反应在胶质瘤的治疗中具有重要地位。方法：第一章第一节对不同种类的胶质瘤细胞进行体外培养,QPCR以及Western blot验证IRG1在胶质瘤细胞及正常细胞中的表达差异。干扰IRG1观察其对胶质瘤细胞增殖及迁移的影响。体外细胞实验,通过Western blot检测细胞周期蛋白、EMT相关蛋白及NF-K B相关通路的蛋白表达水平,筛查IRG1通过何种机制促进胶质瘤细胞的增殖。第一章第二节体内实验,通过对裸鼠皮下注射sh-IRG1以及慢病毒携带IRG1的胶质瘤细胞U251及SHG-44,以注射空白载体作为对照,观察注射胶质瘤细胞40天后肿瘤的生长情况。在体观察IRG1表达受抑制后对胶质瘤细胞增殖能力的影响。第二章临床资料统计分析IRG1表达与胶质瘤患者病程进展及预后的关系。取人脑胶质瘤组织与正常脑组织做对比,通过Western blot比较IRG1的表达水平,观察IRG1表达水平的高低与患者预后的关系。结果：第一章第一节图1显示IRG1在神经胶质瘤中起着重要的作用。在多株神经胶质瘤细胞株A172、U87、SHG-4、17-105、H4、U118MG和u-373MG中,我们通过RT-PCR和免疫印迹检测IRG1的mRNA水平和蛋白水平。图1所见在U251、SHG-44、TJ-105和H4神经胶质瘤细胞系中IRG1 mRNA及蛋白质水平明显高于A251、U118MG和u-373细胞株。更重要的是通过和瘤旁组织组织对比,发现IRG1的蛋白高表达于胶质瘤组织(图1D)。选用siRNA技术,特异性敲低IRG1在胶质瘤细胞中的表达,同时采用si-IRG1-1及si-IRG1-2对IRG1的表达进行敲低,结果显示si-IRG1-2敲低效果比si-IRG1-1更佳(图3a-b及图4),因此,选用si-IRG1-2作为IRGl敲低的工具进行后续实验。通过si-IRG1-1以及si-IRG1-2对U251以及SHG-44细胞进行瞬时转染,后续MTT结果提示(图5)敲低IRG1表达可以抑制43%的SHG-44细胞的增殖(P<0.01),然而过表达IRGl可以促进54%的SHG-44细胞的增殖(P<0.01)。EUD实验结果(图6)显示过表达IRG1可以使得U251以及SHG-44细胞的增殖百分比从23%及25%增加至64%及62%,而通过si-IRG1-2敲低IRG1可以使U251和SHG-44细胞的增殖百分率由23%及25%下降至6%及9%。随后,我们检测了转染si-IRG1-2胶质瘤细胞的细胞周期分布。实验结果提示转染了si-IRG1-2的U251和SHG-44细胞与转染si-NC的对照组细胞相比,胶质瘤细胞周期分布变化为以G1期为主,少部分分布在S期,P<0.01(图7)。这些实验结果提示si-IRG1对胶质瘤细胞的增殖抑制部分是因为G1期阻滞。克隆形成实验显示转染了si-IRG1的U251及SHG-44细胞与转染si-NC的对照组细胞相比,克隆面积更小,差异明显,具有统计学意义(P<0.01,图8)。划痕实验结果提示IRG1敲低可以减少神经胶质瘤细胞的迁移(图9)。在EDU实验中,我们发现敲低内源性IRG1表达组与si-NC对照组相比,IRG1敲低可明显减少U251及SHG-44细胞的迁移及侵袭,(P<0.05,图10及图11)。对稳转IRG1基因的U251及SHG-44胶质瘤细胞的细胞周期蛋白以及上皮间转化的相关蛋白的表达进行检测,发现敲低内源性IRG1表达可激活肿瘤抑制因子pRB以及致癌性细胞周期转录调节因子E2F1的表达,同时下调肿瘤抑制周期依赖激酶阻断剂p21的表达,抑制周期依赖因子CDK4以及CDK6的酶活性(图12)。再次,我们的结果提示抑制IRG1可降低EMT标记基因snail、n-钙黏素、波形蛋白的表达,增加上皮细胞标记物E-钙粘素的表达水平(图13)。众多实验结果表明NF-K B靶基因编码的细胞因子以及生长因子的分泌对NF-K B激活有重要的作用。NF-K B信号通路包括了NF-K B抑制蛋白IK Bs,它是通过IKK途径磷酸化而降解。实验结果提示敲低IRG1的表达可降低NF-K B、 IkBa以及维持肿瘤中NF-K B活性的STAT3水平(图14)。这些结果表明下调IRG1在胶质瘤细胞中的表达可以抑制NF-K B介导的信号通路。第一章第二节通过小鼠体内成瘤实验检测IRG1在体内实验的生物学效应。图6A-B显示注射敲低IRG1的U251细胞的裸鼠中肿瘤平均体积与对照组相比明显减少(>60%,P<0.05,图15a-b)。对肿瘤重量的分析显示,接种转染了sh-IRG1的肿瘤细胞的瘤体比转染sh-vector组瘤体的重量更轻(P<0.05,图16)。这些结果再次验证了前述的细胞实验,说明IRG1高表达能促进胶质瘤细胞的增殖。第二章胶质瘤细胞胞浆中IRG1的表达水平与胶质瘤患者的预后情况密切相关。IRG1免疫组化切片来源于78个胶质瘤组织块以及16个正常脑组织块,免疫组化染色显示IRG2在胶质瘤细胞中有不同程度的表达(图17C-F),但在瘤旁组织中表达很弱或者不表达(图17A-B)。IRG1在胶质瘤细胞中的亚定位大部分在胞浆中,少部分在细胞核中。图表七显示IRG1高表与胶质瘤患者的病理改变密切相关,Ⅲ-Ⅳ级与Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤患者相比,IGRl的表达增高更为显著,差异具有统计学意义(P=0.000)。Kaplan-Meier生存分析显示,与IRG1高表达患者相比,IRGl低表达患者具有更长的无进展生存时间(P<0.05)。表八显示IRG1在胶质瘤及正常脑组织中的高表达率分别为75.6%、37.5%,二者差异明显,具有统计学意义(P=0.006)。结论：1.IRG1在胶质瘤组织中的表达高于正常脑组织。2.IRG1表达与胶质瘤的临床分级相关,可作为胶质瘤患者预后评估的独立因素。3.IRG1与胶质瘤发生发展密切相关,其高表达能促进胶质瘤细胞的增殖及侵袭。4.IRG1促进胶质瘤增殖的作用机制可能与细胞周期因子、EMT因子及NF-κB信号通路相关。