目的:胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。根据GLOBOCAN2018报道,在全世界范围内,其发病率和死亡率分别居于恶性肿瘤发病率及死亡率的第五位及第三位。到2014年,我国每年新增胃癌发病人数至41万,死亡人数至29.4万。目前,手术、放化疗及免疫治疗是胃癌的主要治疗手段,但由于胃癌的确切发病机制及侵袭转移机制目前仍尚不十分清楚,导致对胃癌无法进行理想的早期诊断及治疗。因此,当前亟需寻找与胃癌发生和预后相关的生物标志和胃癌精准治疗的新靶点。环状RNA(circμlar RNAs,circRNAs)是一类经特殊剪切形成的共价闭环RNA,它缺乏传统线性RNA的3’及5’末端,因其环状结构得名。目前发现circRNAs具有多种生物学功能,如作为分子“海绵”吸附微小核糖核酸(microRNA,miRNA),参与转录及转录后调控,作为模板指导翻译等。研究表明,大量环状RNA参与了肿瘤的发生发展过程的调控,有望成为新的肿瘤标记物及治疗靶点。此外,由于circRNA具有miRNA分子“海绵”特性,可作为外源性miRNA的载体,因此也具有良好的临床应用前景。在胃癌中,CircRNA发挥的作用也受到越来越多的关注。有研究通过对3例胃癌患者的癌组织及配对正常胃黏膜上皮组织进行测序,鉴定出180个存在差异表达的circRNA。Zhang等通过体外实验发现,在胃癌中circNRIP1存在异常高表达,且可以吸附miR-149-5p并最终通过AKT1/mTOR发挥其促癌作用。然而,circRNA在胃癌中的确切作用及分子机制尚不明确。此前有研究报道,circRNA＿100290在结肠癌中可通过调控wnt/β-catenin信号通路参与结肠癌的侵袭转移。然而,circRNA＿100290在胃癌进展过程中发挥的作用还清楚。因此,本研究拟检测circRNA＿100290在胃癌组织及细胞中的表达情况以及对胃癌细胞生物学行为的影响,并深入研究相关分子机制;同时针对circRNA＿100290的转录调控进行研究,以明确其表达异常的调控机制。研究方法:1.收集中国医科大学附属一院胃肠肿瘤外科手术切除的新鲜胃癌组织及配对正常胃黏膜组织102例,提取组织RNA后,应用qRT-PCR检测circRNA＿100290在各组织样本中的表达情况,分析circRNA＿100290在胃癌组织及配对正常胃黏膜组课题资助:国家自然科学基金(N0.81971584)织的表达差异,同时对circRNA＿100290在胃癌中的表达与各临床病理因素间的相关性进行分析,探索其在胃癌发生与侵袭转移过程中的作用及分子机制。2.通过qRT-PCR检测miR-29b-3p在30例胃癌组织及配对正常胃黏膜组织中的表达,并应用EBI数据库数据对miR-29b-3p在胃癌中的表达趋势进行验证。对circRNA＿100290与miR-29b-3p在配对胃癌中的表达进行相关性分析,并应用双荧光素酶报告基因系统对circRNA＿100290与miR-29b-3p的结合加以验证。分别应用qRT-PCR检测ITGA11在31例胃癌组织及配对正常胃黏膜组织中的表达,对miR-29b-3p与ITGA11在配对胃癌中的表达进行相关性分析。随后,应用TCGA数据库数据分析ITGA11在胃癌中的表达与各临床病理因素间的关系;应用生物信息学工具STRING构建ITGA11蛋白交互作用网络,并对交互作用蛋白进行富集分析。3.qRT-PCR检测circRNA＿100290及miR-29b-3p在永生化人胃黏膜细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS、BGC-823、HGC-7901及HGC-27中的表达,并从中选取两种胃癌细胞系作为后续研究对象。采用小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)转染沉默胃癌细胞系AGS和HGC-27中circRNA＿100290的表达,检测miR-29b-3p及ITGA11的表达变化。采用划痕愈合实验及Transwell细胞迁移实验评估circRNA＿100290对胃癌细胞迁移能力的影响,采用Transwell侵袭实验评估circRNA＿100290对胃癌细胞侵袭能力的影响;采用平板克隆形成实验及CCK-8细胞增殖实验评估circRNA＿100290对胃癌细胞克隆形成能力及细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术检测评估沉默circRNA＿100290对胃癌细胞周期的影响。为进一步明确可能的分子机制,应用Western blot检测沉默circRNA＿100290后上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transiton,EMT)相关蛋白的变化。4.应用生物信息学软件Circinteractome预测可能参与circRNA＿100290转录调控的RNA结合蛋白eIF4A3。沉默AGS及HGC-27细胞系中e IF4A3表达后,应用qRT-PCR检测细胞系circRNA＿100290的表达。随后,进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验以明确eIF4A3对circRNA＿100290的富集作用。为进一步明确e IF4A3在胃癌的作用,分别应用qRT-PCR及Western blot检测31例人胃癌组织中eIF4A3 mRNA及蛋白的表达情况。随后,应用Kaplan Meier-plotter软件对GEO数据库中eIF4A3 mRNA的表达与胃癌患者预后的关系进行比较分析,并分析胃癌数据集GSE62254中eIF4A3表达与各临床病理因素间的关系。5.实验所得数据使用GraphPad Prism 8.0.2及SPSS 25.0软件分析,相关性分析采用Pearson相关性分析。两组间计量资料采用t检验或t’检验比较,检验水平α=0.05。结果:1.通过qRT-PCR检测circRNA＿100290在102例配对胃癌组织中的表达,结果显示胃癌组织中circRNA＿100290的表达水平显著高于配对正常胃黏膜组织中的表达(P=0.000)。临床病理因素分析显示,circRNA＿100290高表达与Borrmann分型(χ2=4.320,P=0.038)、淋巴结转移(χ2=12.262,P=0.002)及TNM分期(χ2=8.513,P=0.004)显著相关,与性别、年龄、WHO组织学分型、Lauren分型、肿瘤大小及浸润深度未见统计学相关性。2.通过qRT-PCR检测miR-29b-3p在30例配对胃癌组织的表达,结果显示miR-29b-3p在胃癌组织中的表达水平显著降低(P=0.008),与EBI数据库对miR-29b-3p在胃癌中的表达分析趋势一致。CircRNA＿100290与miR-29b-3p在胃癌组织中的表达成负相关(P=0.047,r=-0.3656);双荧光素酶报告实验结果显示,与其它各对照组相比,circRNA＿100290-3’-UTR+mi R-29b-3p组荧光素酶活性显著降低,提示circRNA＿100290可与miR-29b-3p结合。qRT-PCR及Western blot结果显示,ITGA11在胃癌组织中的表达水平显著升高,与应用TCGA数据库数据对ITGA11在胃癌中的表达分析趋势一致。相关性分析结果显示,miR-29b-3p与ITGA11 mRNA在胃癌组织中的表达亦呈负相关(P=0.040,r=-0.3773)。对TCGA数据库中的354例胃腺癌组织ITGA11 mRNA表达状态和胃癌患者的预后进行分析,结果显示ITGA11 mRNA低表达组5年生存率为58%,显著高于高表达组(仅为24%)(P=0.008)。进一步分析375例TCGA数据库中胃腺癌样本ITGA11表达状态与各临床病理因素间的关系,结果显示在胃癌组织中,ITGA11高表达与胃癌的Lauren分型(χ2=7.323,p=0.026)、胃壁内浸润深度(χ2=22.669,p=0.000)及TNM分期(χ2=13.737,p=0.003)有关,与年龄、性别、组织学分级,淋巴结转移及远处转移未见显著相关性。3.qRT-PCR结果显示,circRNA＿100290在AGS、BGC-823及HGC-27细胞中的表达均高于在GES-1细胞中的表达,其中在AGS及BGC-823中的表达水平最高;miR-29b-3p在AGS、BGC-823及HGC-27细胞中的表达均低于GES-1,其中在AGS及HGC-27中的表达水平最低,选取AGS及HGC-27细胞作为后续研究对象。应用si RNA沉默AGS及HGC-27细胞circRNA＿100290的表达后,qRT-PCR结果显示miR-29b-3p表达水平升高,ITGA11 m RNA表达水平降低;划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验结果显示胃癌细胞迁移及侵袭能力明显受到抑制;平板克隆形成实验及CCK-8增殖实验显示胃癌细胞克隆形成能力和增殖活性降低;流式细胞术显示沉默circRNA＿100290表达诱导胃癌细胞周期被阻滞于G0/G1期。Western blot结果显示,沉默circRNA＿100290后,AGS及HGC-27细胞系中E-钙黏蛋白表达升高,而N-钙黏蛋白及波形蛋白表达降低,表明EMT过程受到抑制。4.沉默AGS及HGC-27细胞系eIF4A3表达后,circRNA＿100290表达水平升高;RIP实验显示e IF4A3可以与circRNA＿100290侧翼结合(富集倍数分别为8.18及4.31)。分别应用qRT-PCR及Western blot检测eIF4A3 mRNA和蛋白在31例胃癌组织中的表达,结果显示e IF4A3在胃癌组织中的表达显著降低。应用Kaplan Meier-plotter软件对来自GEO数据库中的876例胃癌组织中e IF4A3 mRNA表达与预后关系进行分析,结果显示,eIF4A3 m RNA低表达组的总生存时间(Overall Survival,OS)及首次进展时间(First Progression;FP)较高表达组显著缩短。进一步分析GEO数据集GSE62254中eIF4A3 mRNA表达与胃癌各临床病理因素间的关系,结果显示eIF4A3 mRNA低表达与Lauren分型(χ2=22.73,P=0.000)、胃壁内浸润深度(χ2=8.897,P=0.012)、TNM分期(χ2=8.916,P=0.030)及ACRG分子分型(χ2=34.989,P=0.000)等因素密切相关,但与原发肿瘤部位、淋巴结转移及远处转移无显著相关性。结论:1.CircRNA＿100290在胃癌中呈高表达,其高表达与Borrmann分型、淋巴结转移及TNM分期显著相关。2.miR-29b-3p在胃癌中表达降低,而ITGA11在胃癌中表达升高。ITGA11高表达胃癌患者5年生存率更低,倾向呈lauren分型中的弥漫型,具有较深的胃壁内浸润深度及更晚的TNM分期。3.在胃癌中,circRNA＿100290可通过竞争性结合mi R-29b-3p,从而解除miR-29b-3p对靶基因ITGA11的抑制作用。4.CircRNA＿100290可通过调控miR-29b-3p/ITGA11信号通路,并促进EMT过程,从而增强胃癌细胞系AGS及HGC-27的迁移、侵袭、增殖及克隆形成能力。5.RNA结合蛋白EIF4A3可以通过与circRNA＿100290的RNA侧翼结合参与circRNA＿100290的转录调控。EIF4A3在胃癌中低表达提示胃癌预后不良。