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格尔德霉素(geldanamycin,GM)及其结构类似物一直是抗肿瘤药物研究的热点,此类化合物的抗肿瘤机制是与肿瘤细胞中的热休克蛋白(heat shockprotein) Hsp90特异结合,导致肿瘤细胞内许多需要Hsp90维持功能的重要蛋白迅速降解,从而抑制肿瘤细胞的生长或引发肿瘤细胞死亡。在前期工作中我们从放线菌新种自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)的次生代谢产物中发现了格尔德霉素和一个全新的化合物,称为为自溶霉素(autolytimycin)。提高此类化合物的产量并获得更加高效、低毒的结构类似物是使它们能够得到实际应用的关键。但是目前对于此类化合物生物合成的调控机制的研究还不是很全面,严重妨碍了我们对其产生菌进行遗传改良。 通过对格尔德霉素生物合成基因簇的生物信息学分析,我们选取了调控基因almRⅠ,almRⅡ和almRⅢ作为研究对象。我们首先表达纯化了AlmRⅠ,AlmRⅡ和AlmRⅢ蛋白,通过EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)寻找这些调控蛋白作用的靶基因。其中AlmRⅠ和AlmRⅡ始终没有找到与其相互作用的基因,而AlmRⅢ蛋白能够与almM和almN基因上游的“TetR-box”结合。almM基因是控制苯醌氧化的单加氧酶基因,almN基因编码氨甲酰基转移酶,都参与格尔德霉素生物合成的后修饰,说明AlmRⅢ蛋白可能参与格尔德霉素生物合成后修饰的调控。 同时我们尝试构建这些基因的敲除突变株以验证其功能,方法是采用Red/ET一步PCR法在大肠杆菌中构建这些基因的插入突变,然后通过接合转移把所构建的突变导入到自溶链霉菌中,经过同源重组获得这些基因的敲除突变株。我们成功地在粘粒pSA2065上构建了almRⅢ基因的插入突变,但是一直没有筛选到敲除了almRⅢ基因的接合转移子。此外,我们构建了携带野生型almRⅢ基因的互补质粒。 本研究的目的在于探明调控基因almRⅠ,almRⅡ和almRⅢ基因在格尔德霉素与自溶霉素生物合成中的作用。该研究有助于我们进一步了解苯醌安莎霉素类抗生素的生物合成调控机制,为将来对其进行遗传工程改造以提高此类化合物的产量和获得新的结构类似物奠定基础。