抱茎苦荬菜中活性倍半萜内酯苷的制备及其生物转化的研究

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抱茎苦荬菜是菊科苦荬菜属植物抱茎苦荬菜[Ixeris sonchifia(Bge.)Hance]的一年生全草,主要分布于我国东北及内蒙古等地。抱茎苦荬菜的化学成分复杂多样,其中的倍半萜内酯类化合物是主要的活性物质。本文利用大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析及制备高效液相色谱等现代分离手段在抱茎苦荬菜中分离得到活性倍半萜内酯苷Ⅰ和Ⅱ。利用光谱分析及参考文献对二者进行结构鉴定,认定其分别为1(10),3,11(13)-愈创木三烯-12,6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷(Ⅰ)和1(10),3-愈创木二烯-12,6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ)。通过实验条件优化,确立了抱茎苦荬菜内酯苷组合物制备工艺方法。利用高效液相色谱法建立了抱茎苦荬菜内酯苷的含量测定方法,并进行了方法学考察。以抱茎苦荬菜内酯苷(包括Ⅰ和Ⅱ)为底物,采用HPLC分析方法,考察了A.versicolor D-1对抱茎苦荬菜内酯苷的转化能力,发现A.versicolor D-1生长细胞和静息细胞对抱茎苦荬菜内酯苷的转化结果完全不同。生长细胞的转化产物为3-羟基-1(10),3-愈创木二烯-12,6-内酯-2-酮(HGD),而静息细胞的转化产物为抱茎苦荬菜内酯苷Ⅱ。转化结果说明,在A.versicolor D-1的生长细胞转化过程中,同时伴随着β-葡萄糖苷键的水解及不饱和内酯环外α,β-碳碳双键的还原;而在其静息细胞转化过程中,只存在催化抱茎苦荬菜内酯苷Ⅰ的不饱和内酯环外α,β-碳碳双键的还原反应。另外,通过HPLC法跟踪检测抱茎苦荬菜内酯苷Ⅰ还原酶的活性,进一步证实了A.versicolor D-1能催化抱茎苦荬菜内酯苷Ⅰ的不饱和内酯环外α,β-碳碳双键的还原,并发现催化该还原反应的酶是一种存在于胞质中的可溶性蛋白。通过单因素实验,采用二步发酵法和HPLC分析方法,考察了初始pH值、温度、底物浓度和底物加入时间对A.versicolor D-1静息细胞转化抱茎苦荬菜内酯苷Ⅰ的影响。实验结果表明,在初始pH值为7.0、温度为28℃、底物浓度为0.2mg/mL条件下,A.versicolor D-1静息细胞转化能力最强。在优化的条件下,考察了A.versicolor D-1静息细胞转化抱茎苦荬菜内酯苷Ⅰ的动态变化过程。动态曲线表明,转化时间达到8h以上,抱茎苦荬菜内酯苷Ⅰ的转化率达到95%以上。
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