猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumonia of swine,MPS）的主要病原体。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）的主要病原。Mhp和PCV2不仅会引起猪的原发性感染,更重要的是对感染猪的免疫系统造成伤害,致使Mhp、PCV2经常会与其他病原并发或继发感染,从而使预防和控制猪呼吸道传染病的难度增加。我国防控Mhp和PCV2感染的主要手段是进行疫苗接种。为了减少疫苗接种次数,降低因疫苗接种引起的应激等因素对养猪业生产的影响,接种联合疫苗已经成为动物疫苗行业发展的趋势。目前,可同时预防Mhp和PCV2两种病原体的二联疫苗已有产品获批上市,但大多是以全菌体灭活的Mhp和杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白以一定的比例混合后制备而成,关于Mhp和PCV2基因工程亚单位和活载体二联疫苗产品仍未见上市。目前,人腺病毒载体系统因其具有安全性好、滴度高以及诱导体液、黏膜和细胞免疫反应强烈等优点,已广泛应用于新型疫苗的研发中。基于此,本研究将实验室前期经原核及杆状病毒表达系统证实具有免疫原性的Mhp P97R1、P46、P42蛋白与PCV2 Cap蛋白克隆到复制缺陷型人5型腺病毒载体上,并将包装出的重组腺病毒r Adv-P97R1、r Adv-P46、r Adv-P42、r Adv-Cap按比例混合后作为活载体疫苗混合免疫BALB/c小鼠,以探讨其诱导机体产生免疫应答的效应,为研制基于腺病毒载体的Mhp和PCV2二联疫苗奠定基础。首先,为了便于后续实验的检测,通过原核表达系统表达了重组PCV2 Cap蛋白,免疫新西兰大白兔制备了抗Cap蛋白的兔多克隆抗体。其次,本研究构建了携带有Mhp P97R1、P46、P42基因和PCV2 Cap基因及携带有绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组腺病毒骨架载体Adv-P97R1、Adv-P46、Adv-P42、Adv-Cap和Adv-EGFP,分别转染HEK293细胞后进行绿色荧光蛋白表达的观察,进一步对重组腺病毒感染后的HEK293细胞进行RT-PCR、Western Blot等实验的鉴定,证实了P97R1、P46、P42和Cap蛋白的表达。在此基础上,对获得的重组腺病毒r Adv-P97R1、r Adv-P46、r Adv-P42、r Adv-Cap,对其进行扩增及纯化。分别将稀释至1.67×10~7 TCID50的r Adv-P97R1、r Adv-P46、r Adv-P42与5×10~7TCID50的r Adv-Cap等体积混合后经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和脾淋巴细胞增殖实验表明,与PBS组、野生型腺病毒r Adv-wild组以及商业疫苗组相比,重组腺病毒组免疫后能诱导机体产生特异性的Ig G抗体（p＜0.0001）。同时,与对照组相比,抗P46与抗P42的Ig G1总体呈下降趋势,抗P97R1与抗Cap的Ig G1则呈稳定不变趋势。混合注射r Adv-Mhp和r Adv-PCV2的抗P97R1的Ig G2a呈上升后下降并维持平稳值直至免疫周期结束;其余实验组的抗P97R1和抗P46的Ig G2a维持基本不变的水平直至免疫周期结束;抗P42的Ig G2a第21 d和第35 d时出现短暂的下降,但后期呈现上升趋势。脾淋巴细胞在被相应刺激原刺激后能产生显著的增殖效果（p＜0.0001）。由以上结果可知,此重组腺病毒免疫小鼠后能够引发小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫效应。本研究为最终研制基于腺病毒载体的Mhp和PCV2二联基因工程疫苗产品奠定基础。