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角膜移植失败最主要原因是术后免疫排斥反应,高危角膜移植术后免疫排斥反应发生率高达60%。移植免疫学最新进展表明,在移植物排斥的反应、发展过程中,T细胞的活化是一个非常复杂的过程,共刺激信号途径是多样化的,单纯阻断其中一个通路虽然能够在一定程度上抑制急性排斥反应的发生,延长移植物存活时间,但不足以诱导稳定、持久的免疫耐受。本实验拟在兔高危角膜移植模型基础上,通过联合阻断CD28和ICOS,探讨角膜移植中急性排斥反应的机制,以及CTLA-4Ig及ICOSmAb对角膜移植排斥反应的影响,减少或防止排斥反应发生,提高移植物存活率。一、实验动物新西兰大白兔,体重1.5-2.0kg,年龄8-12周龄,雌雄不限,购自中国医科大学实验动物中心。兔高危角膜移植受体模型的建立:肌肉注射氯胺酮(50mg/kg体重)和氯丙嗪(10mg/kg体重),联合0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉,选择兔右眼用0/5丝线在偏中央角膜基质间断缝合3针,平均分布于角膜,针距5mm,深度达2/3角膜基质层。选择3个以上象限角膜有新生血管的兔右眼用于实验,当2周后新生血管距角膜中央7mm以内时拆除缝线,并于2-4d后进行穿透性角膜移植术。穿透性角膜移植术(Penetrating keratoplasty,PKP)方法:穿透性角膜移植在角膜缝线拆除2-4d进行,同样,氯胺酮(50mg/kg)和氯丙嗪(10mg/kg)混合肌肉注射全身麻醉,角膜新生血管化兔作为受体,取健康新西兰白兔作为供体。植片与植床直径分别为7.5mm和7.0mm,10-0尼龙线间断缝合12针至水密状态,平衡盐溶液形成前房。术后结膜下注射0.2ml妥布霉素(4mg/ml),抗生素眼膏涂眼。术后每天滴0.3%氧氟沙星眼液1次/d,持续1周。二、实验一选择大于3个象限,新生血管长入距角膜中央7mm内的20只白兔作为高危即新生血管化模型实验组;20只健康白兔作为非新生血管化模型实验组;另健康20只白兔双眼作为供体。分别将新生血管模型组及非新生血管模型组随机分成空白对照组:(植片浸在空白保存液中)(4℃孵育18h),实验组:植片浸在含有CTLA-4Ig(10ug/ml)保存液中(4℃孵育18h)。穿透性角膜移植术后裂隙灯显微镜观察并记录角膜植片情况。术后4周或排斥反应发生时各组4-5只兔的1/2角膜植片分别进行组织病理学和细胞因子原位杂交检测,检测肿瘤坏死因子(TNF)在角膜植片中的表达;比较新生血管化与非新生血管化组移植物存活时间。三、实验二根据是否给予ICOSmAb以及应用量的多少,随机分成5组,每组10只。空白对照组(空白保存液)、实验组:A组(1ug/ml ICOSmAb),B组(10ug/ml ICOSmAb)C组(25ug/ml ICOSmAb),D组(250ug/ml ICOSmAb)。穿透性角膜移植术后裂隙灯显微镜观察并记录角膜植片情况。术后4周或排斥反应发生时抽取静脉血0.2ml,肝素抗凝,作T淋巴细胞增殖实验,检测血液中T淋巴细胞增值能力;术后4周或排斥反应发生时各组的1/2角膜植片进行组织病理学检查(HE染色);术后4周或排斥反应发生时抽取房水100ul应用RT-PCR检测白细胞介素2受体(IL-2R)、IL-10的表达;术后4周或排斥反应发生时余1/2角膜植片应用流式细胞仪检测T淋巴细胞的表达情况。四、实验三随机将新生血管化角膜模型实验动物分成4组,每组10只。联合阻断组:植片为浸入含有CTLA-4Ig(10ug/ml)和ICOSmAb(10ug/ml)的保存液中。ICOSmAb组:植片为浸入含有ICOSmAb(10ug/ml)的保存液中。CTLA-4组:植片为浸入含有CTLA-4Ig(10ug/ml)的保存液中。对照组:单纯行角膜移植,空白保存液。穿透性角膜移植术后裂隙灯显微镜观察并记录角膜植片情况。术后4周或排斥反应发生时抽取静脉血0.2ml,肝素抗凝,作淋巴细胞增殖实验,检测血液中T淋巴细胞增值能力;术后6周或排斥反应发生时各组的1/2角膜植片分别进行组织病理学和细胞因子原位杂交检测,检测肿瘤坏死因子(TNF)在角膜植片中的表达;比较各组移植物存活时间。所用数据以(?)±s表示,采取方差分析q检验(newman-keuls)。P<0.05为有统计学意义,所有数据均由spss11.5软件处理。一、实验一(1)在65只新西兰白兔(65只眼)中仅25只进行角膜新生血管化模型制作,20只兔成功诱导角膜新生血管化并作为受体进行PKP术;另5只兔因发生感染或未达到模型要求而被淘汰。(2)在非新生血管化角膜移植组:对照组和实验各组的植片排斥时间或平均植片存活时间上无统计学意义。超过半数植片(16/30,53%)存活时间超过100天。在新生血管化角膜移植组:实验组孵育于CTLA-4Ig10ug/ml的植片有较长的生存时间。(3)新生血管化角膜移植组之组织病理学HE染色检查:移植术后4周或排斥反应发生时对照组角膜植片水肿,可见新生血管长入,角膜基质中有大量的炎性细胞浸润,以单核和淋巴细胞为主,实验组未见明显的炎性细胞浸润。(4)原位杂交检测:移植术后4周或排斥反应发生时,对照组角膜植片上皮下基质层浸润细胞有明显的TNFmRNA的表达,CTLA-4Ig 10ug/ml实验组未见TNFmRNA表达。二、实验二(1)在78只新西兰白兔(78只眼)中仅53只进行角膜新生血管化模型制作,50只兔成功诱导角膜新生血管化并作为受体进行PKP术;另3只兔因发生感染或未达到模型要求而被淘汰。(2)实验组孵育于ICOSmAb 1ug/ml及ICOSmAb 10ug/ml的植片有较长的生存时间,植片平均存活时间69±34d,75±31d.实验组孵育于ICOSmAb 250ug/ml及对照组的植片发生排斥反应较快,该组移植物平均存活时间分别为10±3d和26±4d。实验A、B组和后两组比较,移植物存活时间有显著性差异(P<0.05);而实验A组和B组比较,移植物存活时间无显著性差异(P>0.05);而实验A、B组和对照组比较,移植物存活时间有显著性差异(P<0.05)。(3)组织病理学HE染色检查:移植术后4周或排斥反应发生时,对照组及ICOSmAb250ug/ml实验组角膜植片水肿,可见新生血管长入,角膜基质中有大量的炎性细胞浸润,以单核和淋巴细胞为主,ICOSmAb 25ug/ml实验组可见少量炎性细胞浸润,而其余实验组未见明显的炎性细胞浸润。(4)移植术后4周或排斥反应发生时对照组及ICOSmAb 250ug/ml实验组前房水中可以检测到IL-2R及IL-10的表达,ICOSmAb 10ug/ml实验组未检测到IL-2R及IL-10。(5)移植术后4周或排斥反应发生时,实验各组与对照组比较,血液中T淋巴细胞增殖能力无明显差别(P>0.05)。6)移植术后4周或排斥反应发生时,对照组与ICOSmAb 250ug/ml实验组CD4~+和CD8~+T淋巴细胞表达均明显上调。ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml实验组CD4~+和CD8~+T淋巴细胞平均荧光阳性百分率与未处理组比较,无显著性差异(P>0.05),而与对照组和ICOSmAb 250ug/ml实验组比较,有显著性差异(P<0.05),说明CD4~+和CD8~+T淋巴细胞表达明显下调。ICOSmAb 25ug/ml实验组CD4~+和CD8~+T淋巴细胞平均荧光阳性百分率有一定程度的下调,与对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。CD4~+T淋巴细胞表面ICOS表达的平均荧光阳性百分率结果显示:对照组与ICOSmAb 250ug/ml实验组ICOS表达明显上调,与未处理组比较有显著性差异(P<0.05);ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml实验组表达明显下调,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),两组之间比较无显著性差异(P>0.05);ICOSmAb 25ug/ml实验组有一定程度的下调,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。CD8~+T淋巴细胞表面ICOS表达的平均荧光阳性百分率结果显示:对照组和ICOSmAb 250ug/ml实验组之间比较,无显著性差异(P>0.05),而与其它三组比较,有显著性差异(P<0.05)。未处理组、ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml实验组三组间比较,无显著性差异(P>0.05)。说明ICOS在对照组和ICOSmAb 250ug/ml实验组表达上调,而在ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml实验组表达上调不明显,而且与CD4~+T淋巴细胞比较,ICOS在CD8~+T淋巴细胞表面表达上调的程度并不明显。三、实验三(1)在65只新西兰白兔(65只眼)中仅45只进行角膜新生血管化模型制作,40只兔成功诱导角膜新生血管化并作为受体进行PKP术;另5只兔因发生感染或未达到模型要求而被淘汰。(2)联合阻断实验A组孵育于CTLA-4Ig 10ug/ml和ICOSmAb 10ug/ml的植片有较长的生存时间109.33±16.38d,与其他组相比较有统计学意义(p<0.05),而ICOSmAb组与CTLA4-Ig组植片存活时间无显著性差异(p>0.05)。(3)组织病理学HE染色检查:移植术后6周或排斥反应发生时,对照组角膜植片水肿,可见新生血管长入,角膜基质中有大量炎性细胞浸润,以单核和淋巴细胞为主,实验B、C组实验组可见少量炎性细胞浸润,实验A组未见明显的炎性细胞浸润。(4)原位杂交检测:移植术后6周或排斥反应发生时,对照组角膜植片上皮下基质层浸润细胞有明显的TNFmRNA的表达,实验B、C组有少许TNFmRNA的表达,实验A组未见TNFmRNA表达。(5)实验组与对照组血液中T淋巴细胞增值能力无差别,无明显统计学意义(p>0.05)。1.阻断B7/CD28共刺激信号途径可以减少或延缓兔高危角膜移植免疫排斥反应,诱导角膜移植免疫耐受。2.阻断B7/CD28共刺激信号途径对于兔非新生血管化角膜移植排斥反应没有明显影响。3.ICOS分子在兔高危角膜移植排斥反应中表达上调。4.ICOSmAb可以通过阻断ICOS共刺激信号途径,诱导兔高危角膜移植免疫耐受,减轻排斥反应,延长移植角膜有功能的存活时间。5.ICOSmAb的最佳给药剂量为10μg/ml。6.联合阻断CD28和ICOS,可明显抑制移植排斥反应,延长移植角膜有功能存活时间,较单一途径阻断效果明显。