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目的(1)构建人降钙素基因相关肽α(hCGRPα)重组逆转录病毒载体(pLNCX2-hCGRPα),制备重组逆转录病毒液,进行病毒滴度测定。(2) hCGRPα基因修饰兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察对BMSCs生物活性和成骨活性的影响。(3)液氮冷冻法制作家兔股骨头坏死模型,观察转基因BMSCs联合白体骨移植治疗股骨头坏死的效果。方法1.制备重组逆转录病毒(1)人工合成hCGRPα基因：根据GenBank中hCGRPα的cDNA编码序列,在5’端与3’端分别加上HindⅢ和EcoRⅤ内切酶位点,人工合成得到hCGRPαDNA片段。(2)构建病毒载体：用HindⅢ和EcoRⅤ同时双酶切pLNCX2和人工合成的hCGRPαDNA片段,纯化后用T4连接酶将hCGRPα重组入pLNCX2中,经测序分析得到重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα。(3)病毒包装：将重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα转染入PT67细胞进行包装,收集病毒液,离心、过滤,进行病毒滴度测定。2.细胞学实验(1)分离、培养家兔BMSCS:选用4～6周龄家兔,于无菌条件下获得兔自体骨髓,使用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心法进行细胞的分离、培养,得到自体原代骨髓干细胞。(2)重组逆转录病毒感染体外BMSCs:于感染前12-18h,取第2代BMSCs以1.5×105/的孔密度接种于6孔细胞培养板中。将细胞随机分为3组：①正常对照组：BMSCs正常培养,不给予特殊处理。②实验组：经pLNCX2-hCGRPα感染的BMSCs组。③空载体组：pLNCX2感染组。(3)将细胞培养至第三代,RT-PCR检测细胞hCGRPα-mRNA的表达；Western-blot检测细胞hCGRPα蛋白的表达。(4)MTT法检测细胞增殖活性；碱性磷酸酶(ALP)活性测定；胶原(Collagen)含量测定；骨钙素(13GP)含量测定；层粘连蛋白(LN)测定。3.动物实验：(1)分组实验：取健康新西兰种家兔74只,2～3月龄,体重2.7±0.5kg/只,雌雄不拘。应用液氮冷冻法随机制作家兔单侧股骨头坏死。造模8周后,随机选取2只处死,行组织形态学检查。其余72只随机分为3组,每组实验动物24只。①A组：转基因BMSCs联合自体支撑骨移植。手术暴露股骨头,于股骨转子部凿取一皮质骨小骨柱,长约4mm、宽约2mm。另向深部挖取数团松质骨小颗粒,术中备用。在颈后部股骨头软骨缘下方开一小骨窗,挖除股骨头内部坏死骨。将术前备用的兔转基因BMSCs(含有pLNCX2-hCGRPα质粒)与松质骨小颗粒混合,植于股骨头软骨下方及头内四周。随后于股骨头内中央位置支撑植入皮质骨骨柱,上端与软骨内面顶紧,远端卡牢。②B组：正常BMSCs联合自体支撑骨移植。手术方式同A组,植入干细胞为正常BMSCs(不含pLNCX2-hCGRPα质粒)。③C组：单纯自体支撑骨移植。手术方式同A组,植入骨不与干细胞混合。(2)观察治疗效果：于植骨手术后第3、6月末处死动物,生物力学与组织形态学HE染色观察治疗效果。结果(1)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα菌液的测序结果与GenBank公布的DNA序列一致。重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα经过包装细胞PT67的包装,其产生的病毒上清液感染NIH3T3细胞,获得稳定表达后,计算病毒滴度为1.7x106pfu/mL,具有较高的感染效率。(2)将hCGRPα基因转染BMSCs, RT-PCR检测转基因BMSCs可表达hCGRPα基因；Western blotting分析可表达hCGRPα蛋白。(3)表达hCGRPα基因的BMSCs (BMSCs/pLNCX2-hCGRPα细胞)与正常培养的BMSCs和只转染空载体的干细胞(BMSCs/pLNCX2细胞)相比,表现出较高的增殖率(P<0.05)。BMSCs/pLNCX2-hCGRPα细胞与BMSCs/pLNCX2细胞和正常BMSCs相比,其ALP、Collagen、LN、BGP的含量明显高于两对照组细胞,具有显著性差异(P<0.05)。而BMSCs和BMSCs/pLNCX2细胞相比,其ALP、Collage、LN、BGP的含量无显著性差异(P>0.05)。(4)于液氮冷冻法造模8周,组织学观测见动物模型侧股骨头组织内出现大量空骨陷窝,并且骨小梁变细、组织稀疏,排列紊乱。部分骨小梁断裂,骨髓腔内造血组织减少,骨细胞出现变性死亡,为典型的股骨头坏死表现。治疗术后3月：A组中新生骨小梁排列基本规则,骨小梁为成熟的骨小梁,并有大量的骨细胞形成；B组标本中骨小梁排列不规则,观察到骨小梁大部分为幼稚的骨小梁,可见骨细胞生成；C组标本骨小梁变细、稀疏、部分断裂,骨髓腔内充满坏死组织碎片,骨细胞变性死亡,造血组织坏死,大量空骨陷窝出现。移植骨治疗术后3个月,测得A组手术侧股骨头软骨下骨、松质骨的平均弹性模量和最大压缩强度均高于B组、C组(p<0.05),而与正常侧相比差异无统计学意义(p>0.05)。移植骨治疗术后6个月A组手术侧股骨头软骨下骨、松质骨的平均弹性模量和最大压缩强度与正常侧相比差异无统计学意义(p>0.05),而C组手术侧股骨头已塌陷。结论(1)利用基因工程技术可成功构建重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα,经包装后的病毒液具有较高的感染效率。(2)应用逆转录病毒介导的方法可将hCGRPα基因转染至兔BMSCs中,转基因BMSCs可表达hCGRPα基因并检测到hCGRPα蛋白的合成。(3) hCGRPα基因可促进BMSCs的增殖,且可提高BMSCs成骨活性。(4)经hCGRPα基因修饰的BMSCs联合自体骨移植可在动物体内提高成骨诱导活性,促进骨组织的修复,提高治疗ONFH的成功率。