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微生物表面展示技术是随着基因工程的发展而兴起的重要生物技术,其中毕赤酵母细胞表面展示体系是近年来发展迅速且应用广泛的一种真核表达体系,运用毕赤酵母细胞表面展示体系展示各种酶作为全细胞催化剂,不仅具有固定化酶的特性及优点,而且制备方法简单,易于回收与再生利用,因此具有广阔的应用前景。在表面展示系统中,锚定蛋白起着关键作用,它决定了目的蛋白表面展示的可能性、表面展示效率的高低和目的蛋白的活性。Pir锚定蛋白由于其与目的蛋白锚定方式的多样化,能满足多种目的蛋白的表面展示需求。本研究主要是探索Pir1p作为锚定蛋白时,酿酒酵母发酵葡萄糖产生乙醇途径中的12种酶蛋白在毕赤酵母中表面展示的可能性,一是希望进一步研究Pirl锚定蛋白的锚定性能,二是希望为细胞外催化产生乙醇奠定理论基础。具体研究内容及结果如下：(1)出发载体的构建先将Pirl锚定蛋白的基因分别与丙酮酸脱羧酶基因(PDC)和乙醇脱氢酶基因(ADH)连接,然后分别导入pPIC9k质粒,从而得到两重组载体,命名为pPDC-9k和pADH-9k,以这两个重组载体作为构建其它酶蛋白展示载体的出发载体；(2)多个目的蛋白表达展示体系的构建以pPDC-9k和pADH-9k为出发载体,通过基因替换的方式构建了其余10个基因的重组9k载体。其中以pPDC-9k为出发载体构建了己糖激酶基因(HXK),磷酸果糖激酶基因(PFK),醛缩酶基因(ALD),磷酸丙糖异构酶基因(TIM),甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH),磷酸甘油酸激酶基因(PGK),磷酸甘油酸变位酶基因(PM),烯醇化酶基因(ENO),丙酮酸激酶基因(PK)9种重组9k载体。以pADH-9k为出发载体构建了磷酸葡萄糖异构酶基因(PGI)的重组9k载体；(3)重组载体在毕赤酵母细胞内整合和表达情况的分析及鉴定将构建好的12种重组9k载体线性化后分别电转入毕赤酵母感受态细胞,获得了对应酶基因的高拷贝阳性转化子。通过免疫荧光分析、细胞壁蛋白提取和Western Blot验证,证明融合蛋白成功地锚定在酵母细胞表面。经传代培养验证证明构建好的重组毕赤酵母显示出良好的遗传稳定性。综上所述,通过Pirl作为锚定蛋白,可以展示激酶蛋白、脱氢酶蛋白、异构酶蛋白、醛缩酶蛋白、烯醇化酶蛋白、脱羧酶蛋白不同种类的蛋白,展示的目的蛋白氨基酸长度可以在247-988之间,蛋白质分子量可以在61kDa-246 kDa之间,目的基因的编码长度可以在741bp-2964bp之间。这些研究结果显示了Pirl锚定蛋白的表面展示能力,同时通过Pirlp作为锚定蛋白,成功实现了酵母产生酒精系列酶蛋白的毕赤酵母细胞表面展示,为将来共展示系统的建立和胞外催化生产乙醇奠定了基础。