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研究背景:迄今为止,在关于退变椎间盘的再生修复的研究中,干细胞移植是恢复椎间盘（Intervertebral disc,IVD）生物学功能最理想的方式之一。目前研究中使用最多的干细胞是骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）,在许多的研究中BMSCs移植都取得良好的效果。Fackson Mwale等人在牛的退变椎间盘（Intervertebral disc degeneration,IVDD）中植入BMSCs,退变椎间盘中的蛋白聚糖含量可以明显提高[1];Lluis Orozco等[2]人在椎间盘退变早期患者的椎间盘中植入BMSCs,结果显示,患者的临床症状有明显好转。但目前关于该技术在退变的椎间盘中的应用仍存在较大争议（例如患者的年龄,细胞移植的时间,移植的具体部位,移植细胞的种类和数量,移植时采用的细胞载体,移植前干细胞的分化方向,椎间盘的退变程度以及其他可能发生的副作用等）,但这项技术仍被公认可以为椎间盘退变的治疗带来广阔的前景。随着椎间盘内不同部位的干细胞的相继发现及确认,关于不同来源的干细胞研究成为了研究热点。目前研究证实了这些细胞在椎间盘的自我修复过程中发挥了重要的作用[3]。近来,随着椎间盘源性干细胞巢理论的提出（其位置大致位于纤维环外周和骺板软骨膜区域）,为椎间盘退变的内源性修复技术提供了理论基础[4]。最近的研究中显示,干细胞巢来源的干细胞与骨髓间充质干细胞拥有着近乎相似的生物学功能,并具有更好的成骨和成软骨分化能力。因此,在关于椎间盘退行性疾病的研究中,潜在的干细胞内源性修复途径得到越来越多的关注[5]。实际上,干细胞"迁移-修复"理论在不同的动物和组织中早已被证实。组织或细胞受到损伤时,会释放特殊的信号分子,招募周围的干细胞迁徙至受损组织区域,达到由干细胞介导的精准修复。椎间盘干细胞巢来源的干细胞（stem cell niche of intervertebral disc-derived stem cells,ISN-SCs）是一类与BMSCs有相似生物学特征的细胞,所以推测其可能具有和BMSCs相似的迁移-修复功能,并同样受到趋化因子的调控。但目前,关于其迁移-修复机制的研究报道却较少,这也限制了对椎间盘内源性干细胞修复理论的进一步研究。因此,本研究首次关注了ISN-SCs在椎间盘退变的组织中的迁徙情况,以及相关趋化因子对它的潜在调节作用。实验方法:1.构建椎间盘退变模型（采用注射器针头针刺椎间盘造模,术后行brdu+喂养）,在术后各时间点（1?2?3?4?5周）使用影像学及组织学评估椎间盘退变情况;2.在相同时间点（术后1?2?3?4?5周）免疫荧光检测brdu阳性细胞追踪干细胞巢和纤维环中干细胞分布情况,qRT-PCR检测CD29?CD90的表达;同时,qRT-PCR也检测了术后第2周时干细胞巢和纤维环干细胞趋化因子表达（包括CCL3?CCL4?CCL5?CCL7?CXCL8）,并进一步筛选表达增加最大的趋化因子（CCL5）,并用免疫组织化学鉴定了CCL5在退变发生后不同时间点的表达情况;3.完成ISN-SCs?BMSCs以及椎间盘细胞的体外分离?培养和鉴定,Transwell细胞实验验证了CCL5对ISN-SCs?BMSCs迁移能力的影响。实验结果:1.MRI?HE以及天狼星红染色确认了针刺椎间盘退变模型的建立;退变在第2周左右迅速加重,并且随着时间的延长,程度进一步加重。2.qRT-PCR结果显示在术后第2周纤维环中CD29、CD90表达较正常组显著增高,但在3、4、5周的时候却较正常组降低;同时,免疫荧光结果也显示,在针刺术后第2周,干细胞巢区域和纤维环中brdu阳性细胞数目较正常组明显增多,之后逐渐降低。3.纤维环中相关趋化因子（CCL3,CCL4,CCL5,CCL7和CXCL8）在术后第2周时表达均较正常组升高（p<0.05）;其中,CCL5表达增高的倍数显著高于其他因子。免疫组织化学染色进一步验证了上述结果。4.体外成功分离?培养出ISN-SCs?BMSCs和椎间盘细胞;qRT-PCR证实ISN-SCs的CD29?CD90和CD44的mRNA水平属于高表达,而CD34?CD45的mRNA水平属于低表达;其中,CD44在ISN-SCs中的表达高于在BMSCs中的表达;5.Transwell细胞实验证实,与正常椎间盘细胞上清相比,退变的椎间盘细胞上清更能显著促进ISN-SCs的迁徙,但这种增强作用能被CCL5抑制剂逆转;同时,外源性的rhCCL5也可以显著增强ISN-SCs的迁徙能力。结论:1.椎间盘纤维环穿刺法可制作椎间盘退变的动物模型。2.在椎间盘退变早期（约2周左右）,干细胞巢干细胞出现增殖,并向椎间盘内迁徙进行修复;但在退变中晚期（约3周之后）,干细胞巢干细胞并未进一步增殖,参与迁徙修复。3.ISN-SCs属于间充质干细胞家族;与BMSCs相比,ISN-SCs具有更好的迁徙能力。4.在椎间盘退变过程中,相关的趋化因子的表达均有显著增加,在这其中,CCL5表达增加最为明显。细胞实验进一步证实CCL5可以显著促进ISN-SCs的迁徙,这提示我们在椎间盘的内源性干细胞修复途径中,CCL5可以作为重要的靶点。