石斛兰（Dendrobiun spp.）为兰科石斛兰属植物,是一种热带气生兰,因其花姿优美、色彩艳丽,成为各国花卉市场上最受欢迎的“四大洋兰”之一。本文研究以石斛兰的茎段和试管苗叶片为材料诱导原球茎,建立石斛兰高效再生体系和受体系统;采用根癌农杆菌介导法对石斛兰原球茎进行ACS反义基因遗传转化的研究。此外,还对石斛兰的试管开花进行了初步探讨。主要研究结果如下:1石斛兰高效再生体系的建立。以石斛兰的茎段和试管苗叶片、石斛兰蒴果（包含4个品种:玫瑰红大花、淡红淡条、紫红、白花）为材料,研究了石斛兰再生系统建立的有效途径。结果表明:石斛兰茎段在KC+0.2 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA培养基中原球茎诱导率为35.57%,KC+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA是叶片诱导原球茎的最佳培养基,诱导率为11.99%;原球茎适宜增殖的培养基为KC+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,增殖倍数达到8.02,而分化培养基为1/2MS+0.5 mg/L 6-BA;最佳的壮苗生根培养基为1/2MS+1.0 mg/L NAA。2石斛兰受体系统的建立及其优化。以石斛兰的茎段和试管苗叶片为材料诱导原球茎,通过不同激素浓度、糖类型和糖浓度建立了淡绿色细小原球茎受体系统。针对pH、琼脂浓度、天然附加物、基本培养基、光照强度、培养方式等影响因素,优化石斛兰原球茎受体系统生长条件。结果表明:附加2.0 mg/L6-BA和0.5 mg/L NAA的KC培养基中诱导出淡绿色细小且致密的原球茎,适宜作为遗传转化的受体系统。原球茎受体系统的最佳培养条件为20.0 g/L白糖为最佳糖源和糖浓度、无任何附加物、pH为5.4、琼脂浓度为5.8 g/L的KC培养基中,采用固体培养方式将原球茎培养于1500 lx光照强度下。石斛兰原球茎对卡那霉素敏感,1500 mg/L卡那霉素能够有效地抑制原球茎的生长并使其致死,而50.0 mg/L卡那霉素能够有效地抑制未转化植株的生根,因此,150.0 mg/L卡那霉素和50.0 mg/L卡那霉素分别为石斛兰进行遗传转化时原球茎受体系统和小苗生根培养的有效选择压浓度。3根癌农杆菌介导ACS反义基因导入石斛兰转化体系的确立。试验结果表明,稳定转化试验条件为不经预培养的石斛兰原球茎,侵染前经过切割后培养于附加0.3 mol/L甘露醇的高渗固体培养基进行前处理6 h,农杆菌重悬液浓度OD₆₀₀为0.8左右,农杆菌重悬液白糖浓度为20.0 g/L,接菌时间为30 min,在25℃黑暗条件下于附加2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的KC培养基中共培养5d,共培养培养基pH值为5.4。以此条件进行了稳定转化试验。4石斛兰抗性原球茎和再生植株的筛选和检测。对转化ACS反义基因的转化体进行抗性筛选及转基因植株再生研究,对再生植株叶片进行GUS稳定表达检测和gus基因的PCR检测。采用延迟筛选法先对侵染过的原球茎在KC+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100.0 mg/L Cef.培养基上进行恢复生长20d,再采用逐步提高卡那霉素浓度后,置于KC+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+150.0 mg/L Kin.培养基下筛选3个月,选择后的原球茎置于1/2MS+0.5 mg/L 6-BA分化培养基上进行分化培养,将分化的小苗转移到1/2MS+1.0 mg/L NAA+50.0 mg/LKm.+100.0 mg/L Cef.筛选壮苗生根培养基中进行生根培养。共获得了13株具有卡那霉素抗性的转化植株,转化效率达到12.15%。转化植株经GUS组织化学检测和gus基因的PCR检测证实gus基因已整合进石斛兰基因组中。转基因植株在形态上与未转基因植株无差别,转基因植株移栽2个月后都已成活。5石斛兰试管苗离体开花的初步研究。以苗龄为2个月左右的石斛兰无根试管苗为材料,研究了适宜于诱导石斛兰开花的培养基。针对基本培养基、6-BA、糖3个因素进行正交设计试验,研究其对开花的影响。结果表明:经过150d的培养后,KC2+5.0 mg/L 6-BA+40.0 g/L白糖培养基中,25.0%的无根小苗能够诱导开花,其花蕾正常,但不能够正常开放。基本培养基、6-BA、糖等3个因素对石斛兰无根小苗开花的影响依次为6-BA＞基本培养基＞糖浓度。总之,本研究建立了石斛兰高效再生体系;获得了淡绿色细小且致密的原球茎受体系统;首次将ACS反义基因转入石斛兰并建立了稳定的遗传转化体系;摸索出了石斛兰抗性原球茎的筛选方法和筛选时期;首次发现在不使用AS时,高浓度糖处理可以提高农杆菌转化石斛兰原球茎的转化效率;摸索出了石斛兰试管苗离体开花的方法。这为选育花期延长的石斛兰新种质,延长石斛兰切花的寿命开辟了新途径,为石斛兰转基因的研究提供了技术平台,及石斛兰离体开花技术奠定基础。