论文部分内容阅读
水稻花器官是水稻生殖发育的基本单位。水稻花器官的形态建成是水稻发育的重要组成部分。水稻花器官形态建成是否能够正常完成将会直接影响水稻产量和稻米品质。因此,研究水稻花器官形态建成的分子调控机制,不仅会促进我们对水稻的生殖发育机制进行深入探索,进一步完善水稻中的ABCDE模型,而且对于现代农业生产也同样具有及其重要的意义。研究表明:从双子叶植物-拟南芥和金鱼草中发现并提出的用于揭示花器官发育调控机制的ABCDE模型只部分适用于揭示水稻花器官形态建成;但是水稻外轮花器官(内外稃)的形态结构较为特殊,这也暗示在水稻外轮花器官(内外稃)的形态建成过程可能进化出新的分子调控机制。本论文一方面通过挖掘新的参与水稻内外稃形态建成调控因子,包括筛选新的水稻外轮花器官突变体,表型分析以及基因克隆。另一方面通过探索水稻内稃形态建成新的的分子机制来进一步解析水稻外轮花器官形态建成分子调控机制。基于前期的遗传学分析,本论文对水稻外轮花器官畸形发育突变体j26进行了初步的表型分析以及基因定位。与野生型花器官相比,突变体的外轮花器官出现了3种畸形转变(I型、II型、III型)。I型的畸型花器官的数量约占突变体花器官总量的55%;其花器官的内稃明显变大并且发生明显伸长,最终导致整个突变体小花都变大。II型的畸型花器官数量约占突变体花器官总量的25%;其花器官的内外稃不能紧密嵌合,且内外稃均转变成畸形形状,育性明显下降。III型花器官数量约占突变体花器官总量的20%;其花器官的外稃发生畸形变化并且明显变小,内稃明显伸长。随后对株高,分蘖数,千粒重等农艺性状观察和分析显示:与野生型相比,抽穗期j26株高降低20%;分蘖数是野生型的三倍;千粒重降低33%。这些结果暗示j26突变中的细胞分化和分裂发生了明显变化。通过图位克隆方法,首先我们通过粗定位将突变基因所在的区间缩小在两个分子标记chr01-04和chr01-05之间。然后在分子标记chr01-04和chr01-05之间,继续寻找9522基因组序列和广陆矮4号基因组序列之间的差异,并利用IGV(TheIntegrative Genomics Viewer)软件在这些差异位点的两端设计In Del引物,我们中设计了12对In Del引物(J1-J12)进行精细定位。我们随后以579株j26突变体植株为材料,通过精细定位将J26基因定位在第一条染色体In Del分子标记J5和J6之间,遗传距离0.5 CM,包含64个候选基因。目前已完成对12个可能的候选基因的定量检测,且对包括DFO(DEFORMED FLORAL ORGAN),cyclin-A1,KH domain containing protein,VHS and GAT domain containing protein在内的这四个基因的完整的基因测序分析,但是并没有发现突变位点。q RT-PCR分析表明,与野生型相比,j26突变体中的与水稻内外稃发育相关基因Os MADS34和REP1基因的表达发生明显下调,这暗示J26基因很可能通过与花器官发育相关基因的相互作用来调控水稻花器官的发育。这些工作为我们对J26调控水稻花器官形态建成的分子机制的深入研究奠定了基础。RETARDED PALEA1(REP1),Os MADS6和Os MADS32是实验室前期通过正向遗传学方法筛选所获得的三个参与水稻内稃形态建成调控的关键基因。但是这两个基因是否会在分子水平上发生相互作用以及通过何种方式在分子水平上发生相互作用来最终调控内稃细胞的分裂分化等生物学问题尚不得知。本论文在前期研究工作的基础上,通过Luciferase报告基因的实验验证RETARDED PALEA1(REP1)和Os MADS6是否对细胞分裂和分化相关基因如Cyc D3;1和Cyc D6;1等具有调控作用。然后,我们通过构建Ubipro::REP1再次确认REP1对内稃发育所起到的调控作用。此外,我们还通过构建启动子与基因片段互换的方法,即构建Os MADS6pro::REP1gdna-3’utr和REP1pro::Os MADS6g DNA-3’utr来研究Os MADS6和REP1的表达是否存在相互拮抗的调控机制;同时我们也通过构建Os MADS6pro::VENUS::Os MADS6g DNA为丰富Os MADS6的调控网络做充分的准备。同样通过构建Os MADS32pro::VENUS::Os MADS32g DNA为丰富Os MADS32的调控网络做充分的准备。我们还构建了REP1pro::VENUS::g DNA质粒及REP1pro::e GFP::g DNA质粒进行rep1-1突变体转化。综上这些实验将为我们进一步研究REP1,Os MADS6和Os MADS32的下游调控网络奠定基础。