结核病是一种由结核分支杆菌在人与动物或者人与人之间传播引起的人畜共患病。牛结核病在全世界范围内传播严重的影响了人类健康和农业发展,特别是在亚洲和非洲的一些发展中国家,由于没有有效的政策和方案来消除或控制,结核病的危害尤其严重。因此控制和抵御结核菌传播的研究变的紧迫和重要。有文献报道小鼠SP110基因可以控制结核杆菌的生长并且诱导感染细胞凋亡,本研究的前期工作也确认SP110基因可以增强牛巨噬细胞的抗结核菌功能。因此本研究旨在通过TALE核酸切口酶在荷斯坦奶牛基因组上定点插入SP110基因,生产具有抵抗结核杆菌侵染功能的转基因牛。基因组编程酶TALEN能够在精确位点对基因组进行切割,因此被广泛用于基因功能研究以及转基因动物的生产。在过去的两年中,TALEN介导的基因敲除已有大量文献报道,但是基因敲入成功的例子却非常少;TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物并生产转基因动物,但是尚未见有TALEN介导基因敲入的转基因牛报道。本研究首次利用TALE核酸切口酶在牛基因组上进行基因敲入,并生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。通过体外攻菌证明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖,结核杆菌侵染的转基因细胞会启动凋亡途径而不是坏死途径;通过体内攻菌以及细菌传染试验证明转基因牛可以有效的抵御结核杆菌的侵染。本研究的主要内容如下所示:1.针对牛28号染色体的表面活化蛋白A1(SFTPA1)和甲硫氨酸腺苷基转移酶I A(MAT1A)的基因间序列设计3对特异性的TALENs。使用荧光素酶单链退火实验在人的293-FT细胞中对TALENs的切割活性进行的了初步鉴定。随后用Surveyor酶切实验在牛的胎儿成纤维细胞中进行了进一步检测,以DNA切割后发生非同源末端连接修复的比率来表征TALENs的切割活性,结果表明所设计的三对TALENs中,第二对TALEN的切割活性最高。2.在野生型TALEN右臂的FokI酶中引入一个点突变(第450位天冬氨酸突变为丙氨酸),该点突变可以消除右臂FokI的酶切活性,但不影响TALEN二聚化以及DNA序列的识别,从而构建TALE核酸切口酶系统。DNA体外切割试验证明了该系统可以在预期的位点造成单链断裂,并具有将DNA修复途径限定为同源重组的能力。3.获得SP110定点打靶的阳性细胞克隆。通过junction PCR及Southern blot实验确认为定点打靶并且筛选出单等位基因打靶的细胞。以此细胞为核供体,通过体细胞核移植生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。4.对转基因牛的巨噬细胞进行体外攻菌试验,结果表明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖。利用流式细胞术分析攻菌后巨噬细胞的凋亡率和坏死率,发现结核杆菌侵染的普通巨噬细胞会启动坏死途径,而转基因牛巨噬细胞则会启动凋亡途径;使用支气管点滴法进行体内攻菌试验,尸检发现转基因牛脏器的病理得分以及荷菌数均明显低于普通牛;通过将转基因牛与结核病牛在密闭环境下共同饲养的方法进行模拟传染试验,皮试检测、伽马干扰素释放水平检测以及酶联免疫斑点检测均证明转基因牛具有拮抗结核菌的功能,尸检发现转基因牛脏器的病理得分显著低于普通牛。5.针对肌成束同源蛋白1(FSCN1)和肌动蛋白(ACTB)的基因间序列设计并构建3对TALENs并获得针对F-A位点打靶的单克隆细胞。通过序列相似性比对,在牛基因组上分别找了8个靶向M-S位点和F-A位点TALE切口酶的潜在脱靶位点并进行脱靶效应分析。在22株F-A位点打靶细胞和19株F-A位点打靶细胞中发现一株细胞克隆存在脱靶效应。说明TALE切口酶虽然可以在牛基因组上任意位点进行基因操作,但仍有可能会对细胞造成不可预知的损伤,因此在基因敲入前需要注意寻找可以容纳外源基因的“安全港湾”。本研究首次利用TALE切口酶对牛基因组进行基因敲入,并生产出具有抗结核病功能的转基因牛。研究结果不仅对牛结核病的防御与控制有重大意义,同时为动物抗病育种提供新思路。