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目的肺癌是危害人类健康的主要疾病之一,按病理类型分为非小细胞肺癌(None Small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)。近10年来随着对肺癌分子生物学进行深入研究,针对EGFR(Epithelial Growth Factor Receptor,表皮生长因子受体)、ALK(Anaplasticlymphoma Kinase,间变性淋巴瘤激酶)融合蛋白的分子靶向药物的临床广泛应用,晚期非小细胞肺癌生存时间及生活质量取得明显的延长和提高,为NSCLC开辟了新的治疗途径。小细胞肺癌患者占全部肺癌的15~20%,SCLC的生物学特征:肿瘤细胞倍增时间短;早期容易出现远处转移;一线化疗敏感性高等特性。然而近30年小细胞肺癌治疗疗效几乎停步不前,5年生存率不到5%。目前SCLC主要治疗措施为全身化疗或联合局部放疗,一线化疗有效率达60-80%,而化疗后极易耐药,导致复发转移;二线治疗目前缺乏有效的治疗手段。目前研究发现SCLC存在大量体细胞突变及异质性,尽管关于小细胞肺癌的临床试验进行了很多,但是最后证明有效的却很少,迄今尚未发现有效的分子治疗靶点。SCLC一致以来就是临床研究中的一项难题,迫切需要新的有效治疗手段。较为热门的研究主要集中在改善化疗耐药以及新的治疗手段(如免疫治疗、生物导弹治疗等)研发。细胞凋亡由多基因调控的细胞程序化死亡方式,以维持内环境稳定;在恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用。凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Proteins,IAPs)是一族主要凋亡抑制因子,包括8种蛋白因子。Survivin基因即是IAPs中一名重要的家庭成员,在组织细胞的分布上具有鲜明的特点,主要表现为细胞分布上的选择性,即除了胸腺和生殖腺组织细胞外在成年人其他分化组织细胞中皆未表达,主要表达在大部分的恶性肿瘤细胞组织中。其主要功能为:促进细胞的生长增值,抑制细胞凋亡。近几年研究发现Survivin基因与肿瘤细胞对化疗产生耐药性密切相关,可能为肿瘤化疗耐药的机制之一。近年来Survivin基因在肺癌方面的研究逐渐增多。NSCLC患者Survivin蛋白在肿瘤组织中高表达,与临床分期较晚、无病生存期短及总生存时间短密切相关,可能作为一种NSCLC患者诊断敏感指标和治疗靶点。但目前大部分试验主要集中在NSCLC,对于SCLC研究目前尚处于探索期。特别针对SCLC的前期化疗敏感,极易耐药导致复发转移的特点,探索Survivin基因在小细胞肺癌的发生发展的作用及逆转化疗耐药,提供可行性及必要性,以便能找到有效的治疗手段。方法1、采用免疫组化方法(SP法),检测120例SCLC癌组织和13例癌旁正常肺标本中Survivin蛋白的表达情况,并结合患者基本临床资料及随访结果进行相关分析。2、利用脂质体包裹Survivin基因序列特异性siRNA,转染人小细胞肺癌细胞株NCI-H446,实验分为3组:Survivin Si RNA转染组(Si-Sur组),无意Si RNA转染组(Si-NC组)和单纯脂质体转染组(正常对照组)。采用RT-PCR、Western blot技术检测Survivin m RNA及蛋白表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测肿瘤细胞在增值方面的具体情况;微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(Transwell实验)小细胞肺癌细胞迁移能力。3、体外实验利用脂质体包裹Survivin Si RNA,转染人小细胞肺癌耐药细胞株NCI-H446/VP,实验分为3组:Survivin Si RNA转染组(Si-Sur组),无意Si RNA转染组(Si-NC组)和单纯脂质体转染组(正常对照组)。观察癌细胞的生物特性的变化;采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。Western blot检测细胞survivin蛋白、Bcl-2蛋白,Bax蛋白及Cleaved Caspase-3蛋白的含量与相关性,初步探索SURVIVIN逆转耐药机制。结果1、Survivin蛋白在小细胞肺患者中阳性表达率为62.5%(75/120),而在正常13例肺组织中,有1例病灶旁正常肺组织的Survivin蛋白弱表达,所占比例为7.7%,两组的差异具有明显的统计学意义(p<0.05)。在混合型SCLC患者18中,有5例(27.8%)患者的Survivin蛋白弱表达,而在单纯SCLC患者中,68.6%(70/102)患者的Survivin蛋白高表达,具有明显的统计学意义(P<0.05)。大约16.7%(2/12)小细胞肺癌局限期(T1-2N0M0)期的患者中存在Survivin蛋白表达,且为弱表达。而其他局限期及广泛期患者中Survivin蛋白表达比例分别为:58.5%(24/41),73.1%(49/67)。表明Survivin蛋白在SCLC中随着临床分期的升高,其阳性率也逐渐增高,其差异具有统计学意义(p<0.05)。在脑转移的SCLC中,Survivin蛋白表达的比例大约91.5%,在无脑转移的SCLC中阳性表达率只有20.4%,二者之间的差异明显,具有统计学意义。在SCLC中Survivin蛋白表达情况与性别、年龄及吸烟等无明显相关性。癌组织Survivin蛋白表达是影响小细胞肺癌患者预后的独立危险因素,高表达组与阴性表达组的中位生存时间比值为8月:17月,无进展生存期为4:8月。2、RT-PCR及Western blot检测发现Si-Sur转染组相对于对照组,NCI-H446细胞Survivin基因在m RNA及蛋白水平明显下降。观测NCI-H446细胞经各组处理后在1周内的增殖情况;MTT实验结果提示在Si-Sur脂质体转染组细胞增殖明显受到抑制,而在Si-NC组与空白对照组中NCI-H446细胞的增殖速度无明显差异,三组之间具有明显差异,并具有统计学意义。同时也观察到Si-Sur脂质体转染NCI-H446细胞后体积、排列情况也发生明显变化;Transwell小室结合结晶紫染色检测细胞侵袭能力结果显示:通过酶标仪测量OD值,结果显示Si-Sur组细胞OD值与对照组相比明显降低,存在显著性差异(F156.350,P<0.05)。而阴性对照组OD值与对照组的数值相比略为下降,并没有表现出明显的差异(P>0.05)。在Si-Sur组肿瘤细胞侵袭能力受到明显抑制。3、NCI-H446/VP细胞在不同依托泊苷浓度中Si-Sur组细胞与Si-NC组以及空白对照组相比,存活率较低,存在着显著的差异变化,具有统计学意义,而对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。这表明Si RNA Survivin可以一定程度上逆转NCI-H446/VP细胞对依托泊苷的耐药性。在Si-Sur转染组中,对依托泊苷的耐药指数是7.62,对照组中转染Si-NC和NCI-H446/VP对依托泊苷的耐药指数分别是11.17、11.39,三组之间具有明显差异,具有统计学意义(P<0.05)。为了解其逆转耐药作用机制,流式细胞仪分析检测三组(Si Survivin组、Si NC组及空白对照组)细胞凋亡水平分别为49.512±0.248;5.500±0.529;4.890±0.854。Western blot检测实验三组Survivn蛋白分别为0.032±0.012,0.081±0.007,0.123±0.004;Cleaved Caspase-3蛋白为1.374±0.015,0.240±0.016,0.232±0.033,Bax蛋白为0.334±0.015,0.077±0.005,0.046±0.005;Bcl-2蛋白为0.045±0.013,0.147±0.012,0.381±0.017,对三组的蛋白进行比较,可以发现三组之间的数据具有显著性的差异,具有统计学意义(P<0.05)。根据检测结果可知对比正常细胞对照组、阴性对照组,Survivin蛋白在Si-Sur组条带灰度值减弱,表明Survivin的表达出现了鲜明的下调现象,三组之间表现出了明显的差异,具有统计学意义(P<0.05),提示Si-Sur可抑制Survivin的蛋白表达。Western blot检测各组Survivin蛋白、Cleaved Caspase3、BAX蛋白及Bcl-2蛋白的表达情况,结果显示在Si-Sur组Cleaved Caspase3蛋白及Bax蛋白显著升高,而Bcl-2蛋白的表达显著下降。对比空白对照组、阴性对照组在Si Survivin组中Cleaved Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达,差异显著具有统计学意义(P<0.05)。结论1.SCLC组织Survivin蛋白高表达,与患者临床分期、脑转移及化疗疗效密切相关,癌组织Survivin高表达的患者预后较差。2.脂质体包裹的Survivin特异性si RNA能抑制人小细胞肺癌细胞Survivin蛋白表达,并具有抑制细胞增殖生长及迁移能力。3.Si-Sur脂质体对依托泊苷耐药细胞株能逆转耐药,增加化疗敏感性;可能机制为诱导凋亡,主要通过增强BAX,Cleaved Caspase-3蛋白的表达,减弱细胞Bcl-2蛋白的表达,使细胞凋亡水平明显增加。可能通过对凋亡分子的调控来实现对细胞凋亡的诱导促进作用。