玉米籽粒突变体是研究玉米种子发育的重要材料,对突变体基因的克隆和功能分析不仅可以了解玉米种子的发育机制,而且具有潜在的应用价值。到目前为止,国内外的研究人员已经对玉米籽粒突变体做了大量的研究工作。本实验室之前已经利用玉米自交系B73与Mutator (Mu)活性系杂交,构建了一个玉米籽粒突变体库,其中有多个符合3:1分离比的隐性突变体,本研究选取其中两个玉米籽粒突变体进行基因克隆和功能分析,其中一个是玉米穗发芽突变体(vp-wl2),另外一个是玉米小粒突变体(smk-wl10)。,穗发芽突变体vp-wl2的种子呈灰白色,突变体种子成熟前在雌穗上萌发,胚乳缺少正常的类胡萝卜素组分,积累ζ-胡萝卜素,ABA合成受阻。利用改进的DLA法克隆到引起vp-wl2突变体发生穗发芽的基因是玉米的ZDS基因(zeta-carotene desaturase gene)。vp-wl2突变体的ZDS基因在第一内含子和第二外显子之间有一个Mu9转座子的插入,导致该基因不能正常转录而发生突变。之前有研究认为ZDS基因可能是vp9突变体的结构基因,也有可能是vp9位点调控了 ZDS基因的表达,但是没有直接的证据能证明二者的关系。为了证明二者的关系,将vp-wl2突变体和三个vp9突变体做了等位测验,结果发现,vp-wl2是vp9的一个新等位突变体,进而证明了vp 的结构基因是ZDS基因。已有研究表明,类胡萝卜素主要在叶绿体中合成,利用玉米原生质体和烟草叶片对ZDS-YFP蛋白进行瞬时表达发现,ZDS蛋白定位在叶绿体中。ZDS蛋白是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶,该蛋白在合成后会被运送到叶绿体中催化类胡萝卜素的生物合成,因此,ZDS基因突变后会导致玉米籽粒缺少类胡萝卜素,使ABA的合成受阻,ABA含量不足就不能维持胚在发育过程中的休眠状态,最终导致穗发芽的表型。smk-wll0是一个小粒突变体,大部分小种子的胚发育受阻,只有一小部分小种子能够发芽,少数突变体在田间能散粉,但是不能形成正常的雌穗。通过观察种子发育过程中的切片发现,突变体的胚发育滞后,胚乳发育也不正常,胚乳基部转移层细胞(BETL)不能形成向内生长的细胞壁,进而影响营养物质从母体向胚乳运输。利用图位克隆法将smk-wll0基因定位在玉米2号染色体短臂上433 kb的区间内,区间内有7个开放阅读框,分别是ORF1到ORF7,在突变体中7个候选基因的DNA序列没有发生改变,与B73的参考基因组一致。其中只有ORF2在突变体幼苗和种子中均不表达,其余候选基因在突变体和野生型中均表达,且表达差异不显著。进一步研究发现,ORF2的启动子区CHG甲基化程度较高,经过分离群体的验证发现,启动子区域的CHG甲基化程度与ORF2表达水平呈负相关关系。ORF2编码微管蛋白折叠辅助因子B,拟南芥中该基因的直系同源基因突变会引起胚致死,因此,推测ORF2是smk-wllD的候选基因。以上的实验结果表明,玉米ZDS基因突变后会阻断类胡萝卜素的生物合成,导致ABA含量降低,进而出现穗发芽的表型;玉米微管蛋白折叠辅助因子B基因的不表达很可能会导致玉米种子发育受阻,影响籽粒的正常生长。这些发现为我们解析玉米籽粒的发育过程提供了新的实验证据。