细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，其活性在肿瘤中通常异常增强，因此长期以来，CDK一直被认为是抗肿瘤药物研发的较好靶点之一[1，2]。迄今为止，已有一个CDK4/6抑制剂palbociclib(PD-0332991)成功上市，用于乳腺癌临床治疗，另有近20个CDK抑制剂正在进行临床研究[3]。LS-007是本课题组与澳大利亚南澳大学合作研发的新型CDK抑制剂[2]。前期结果表明，该化合物可显著抑制CDK9活性，是目前已报道的最有效的CDK9抑制剂之一[2，4]。该化合物对慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）有较好的实验治疗作用，对卵巢癌的体外生长也有一定抑制[4，5]。本课题旨在全面系统地评价LS-007实验治疗血液系统肿瘤(hematologic malignancies，HM)（主要是淋巴瘤和急性白血病）的药效及作用机制并探索其与其它靶向化合物联合使用的可能，为其进一步研发提供临床前实验依据。　　分子水平实验结果显示LS-007选择性作用于CDK家族，其对CDK1、CDK2、CDK4、CDK9均有很强抑制，IC50分别为8，3，8，6nM;对CDK6、CDK7(IC50分别为38和134 nM)和CDK8（100 nM浓度时的抑制率仅为28％）的抑制活性则相对较弱。但该化合物对CDK以外的其他测试的41种激酶，除了在100 nM时对GSK3β有55％抑制率外，对其余40个激酶在该浓度则均无明显抑制。在细胞水平，我们则发现LS-007可显著抑制CDK9对下游RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraseⅡ，RNA polⅡ)ser2位的磷酸化，对CDK1、CDK7下游信号通路也有很强抑制，但稍弱于其对RNA polⅡ ser2位磷酸化的抑制。此外，在受试浓度下，LS-007对RB磷酸化无明显影响，表明虽然在分子水平该化合物对CDK2、CDK4和CDK6也有较好的抑制活性，但在细胞水平，它对这三个CDK并无明显作用。体外增殖抑制实验结果显示LS-007具有很强的体外抗肿瘤活性，对不同类型人白血病及淋巴瘤细胞株均有很好的增殖抑制作用。此外该化合物还可明显抑制急性儿童白血病病人骨髓样本来源的淋巴细胞的生长，在人淋巴瘤Pfeiffer SCID小鼠皮下移植瘤模型上该化合物也能显著延缓皮下移植瘤的生长，80 mg/kg LS-007连续口服给药17天后所得T/C％为59.36％。LS-007通过显著抑制CDK9，继而降低CDK9所调控的抗凋亡蛋白Mcl-1和XIAP的mRNA及蛋白表达，引起人淋巴瘤细胞和白血病细胞发生caspase依赖的凋亡。在病人白血病骨髓样本中，LS-007也显示出相同的作用效果，显著诱导白血病样本细胞发生凋亡。　　弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large-B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma，NHL）中最常见的类型，约占总NHL发病率的30-40％[6]。目前DLBCL病人的平均中位生存期已大于8年，然而超过25-30％的病人病情会复发，因此仍需寻找更有效的治疗方法[7]。我们的前期研究结果显示LS-007对其有一定治疗效果，有继续研发的前景。但在研究中也发现LS-007能引起DLBCL细胞中H3K27甲基化增加，使被H3K27me3(H3K27trimethylation)抑制的基因转录被进一步抑制。H3K27的甲基化修饰主要由组蛋白甲基转移酶PRC2(polycomb repressive complex2)复合物和组蛋白去甲基转移酶UTX和JMJD3共同完成。前者由复合物中具有set域催化功能的EZH2甲基化H3K27，后两者则对H3K27进行去甲基化修饰。在多种肿瘤中，H3K27me3的表达水平与肿瘤侵袭转移、恶化程度、化疗耐药等呈正相关，尤其是在DLBCL的治疗中已有文献表明降低H3K27三甲基化水平能有效抑制该类肿瘤的体内外生长，在相应的临床试验中EZH2特异性抑制剂也获得了令人振奋的结果。因此我们推测H3K27me3水平上调可能会削弱LS-007对DLBCL的治疗作用，并考虑通过使用目前正进行临床试验的两个EZH2抑制剂GSK126和EPZ6438，遏制LS-007引起的H3K27me3上调，增强其抗DLBCL特别是EZH2突变型DLBCL的效果。GSK126和EPZ6438者是高度选择性的SAM竞争型EZH2抑制剂，临床前和正进行的临床试验结果均表明两化合物可降低细胞内H3K27me3水平，活化PRC2靶基因转录，发挥抗肿瘤效果。我们的结果表明LS-007与EZH2抑制剂合用能协同抑制EZH2突变的DLBCL细胞的体内外生长。EZH2抑制剂能够克服LS-007引起的H3K27me3水平上调，并逆转LS-007对H3K27me3下游靶基因的抑制，激活这些基因的转录。LS-007与EZH2抑制剂合用通过诱导EZH2突变型DLBCL细胞发生凋亡和DNA损伤，协同发挥体内外增殖抑制作用。　　进一步探索LS-007促进H3K27甲基化发生的机制，结果表明同样具有CDK9抑制活性的flavorpiridol或干扰CDK9均能增加细胞内H3K27三甲基化水平，而且CDK9干扰的DLBCL细胞对EZH2抑制剂敏感性也有明显加强，提示LS-007促进H3K27甲基化的作用与其对CDK9的抑制活性相关。后续实验证实，DLBCL细胞中，CDK9活性被抑制后，调控H3K27甲基化的JMJD3、UTX、EZH2及EZH1mRNA和蛋白表达均受到抑制，但对JMJD3和UTX的抑制相对更明显，最终导致细胞内H3K27三甲基化的明显增强。以上结果提示，具有CDK9抑制活性的化合物与EZH2抑制剂之间可能存在协同抗肿瘤效果，有待进一步临床研究证实。　　在LS-007和EZH2抑制剂的联合作用研究中，考虑到EZH2抑制剂发挥作用较缓慢等原因，我们还探索了不同的联合给药方案。结果表明，当采用序贯疗法（即EZH2抑制剂预先处理，后加LS-007共同作用），随着预处理时间的延长，LS-007与EZH2抑制剂的合用对野生型DLBCL的细胞生长也具有显著协同抑制。这一结果提示LS-007与EZH2抑制剂的合用应有更广泛的应用范围，这也为拓展EZH2抑制剂的临床应用空间提供可能。　　在恶性肿瘤的发生发展过程中，不仅存在细胞增殖失控，同时也存在细胞凋亡的失控，凋亡抑制基因和凋亡活化基因常异常表达，因此对肿瘤细胞凋亡进行干预性调节已成为肿瘤治疗的一种重要策略，尤其争对白血病的治疗中，该策略尤为有效[8]。前期研究结果表明LS-007抑制CDK9活性，从而下调抗凋亡蛋白Mcl-1和XIAP的表达，诱导白血病细胞发生凋亡。在此我们进一步考察LS-007与另一类凋亡诱导剂Bcl-2抑制剂ABT-199之间是否具有协同抗急性白血病的作用。结果表明，LS-007与ABT-199合用细胞中XIAP表达量显著降低，且LS-007可遏制ABT-199引起的Mcl-1上调，两药联用能够协同诱导急性白血病细胞发生PARP切割与caspase3活化，协同诱导细胞凋亡。　　综上所述，新型CDK抑制剂LS-007通过抑制CDK1、CDK7、CDK9（尤其是CDK9）活性，诱导白血病和淋巴瘤细胞发生凋亡，最终对白血病和人淋巴瘤显示了较好的实验治疗作用，是一种潜在的新型抗肿瘤药物。