牛支原体是导致牛支原体病的病原体,主要引起牛呼吸综合征、关节炎及奶牛乳腺炎等多种疾病。病原分泌蛋白直接参与病原体和宿主的信息交流,是病原体发挥致病和免疫作用的重要组分,可望作为药物和疫苗的潜在靶标。然而牛支原体分泌蛋白研究刚刚起步,已鉴定的分泌蛋白很少,其在致病与免疫中的作用有待研究。本研究基于蛋白质组学技术以及生物信息学分析,寻找牛支原体强弱菌株具有功能的分泌蛋白,为牛支原体致病机制研究奠定基础。取得如下结果:1.以牛支原体强毒株HB0801和其传代150代的弱毒株为研究对象,通过摸索适合的无血清培养基,建立牛支原体分泌蛋白的提取方法,利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-D)和非标记定量蛋白质组学(Label-Free)分离、鉴定并量化牛支原体强弱菌株分泌蛋白的表达情况,对8个分泌蛋白的生物学功能进行了初步分析。利用蛋白质组学质谱分析,共鉴定牛支原体分泌蛋白548个,有效的分泌蛋白477个,理论分子量介于10kDa-90kDa。其中较牛支原体弱毒株P150,牛支原体强毒株P1上调的分泌蛋白有66个,下调的分泌蛋白有48个;46个分泌蛋白只在P1中鉴定到,5个分泌蛋白只在P150中鉴定到。对鉴定出的牛支原体强弱菌株分泌蛋白进行KEGG通路分析和GO富集分析,发现牛支原体强毒株P1的分泌蛋白较弱毒株P150在以下蛋白质富集度具有显著性差异:生物过程(Biological Process)中,核糖核蛋白复合物的生物合成(Ribonucleoprotein Complex Biogenesis)、核糖体合成(Ribosome Biogenesis)、细胞对DNA损伤反应(Cellular Response to DNA Damage Stimulus)、DNA修复(DNA Repair)、细胞成分生物合成(Cellular Component Biogenesis)和细胞应激反应(Cellular Response to Stress);在细胞组分(Cellular Component)中,胞内核糖核蛋白复合物(Intracellular Ribonucleoprotein Complex)和核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein Complex);在分子功能(Molecular Function)中,结构分子活性(Structural Molecule Activity)和组成核糖体结构(Structural Constituent of Ribosome)。牛支原体弱毒株P150分泌蛋白受到显著性影响的通路为核糖体(Ribosome)和磷酸转移酶系统(Phosphotransferase System)。通过亚细胞定位和分泌类型预测,发现有15个分泌蛋白定位于外膜(Outer Membrane),2个分泌蛋白在胞外(Extracellular);65个分泌蛋白是非经典型(Non-classical)分泌类型,而有53个分泌蛋白是经典型(Classical)分泌类型。2.选取了8个的分泌蛋白MbovP103(PDHB)、MbovP145、MbovP174、MbovP339(VspY1)、MbovP481(EF-Tu)、MbovP676(EF-G)、MbovP725、MbovP796作为研究对象,对这些分泌蛋白进行克隆表达、多克隆抗体血清的制备,并验证了它们的免疫原性。另外,在探究分泌蛋白炎性反应的功能中,发现分泌蛋白rMbovP339蛋白能够促进牛巨噬细胞BoMac的炎性反应。利用本实验室前期构建的牛支原体转座子突变体库筛选得到rMbovP339的突变菌株,在感染比为1000的条件下刺激牛巨噬细胞BoMac 12h后,发现其促炎因子IL-1β和IL-6 mRNA表达水平显著降低;同时,将去除内毒素的rMbovP339蛋白(10μg)刺激BoMac 12h后,促炎因子IL-1β和IL-6 mRNA表达水平显著升高,IL-1β和IL-6证明了Mbov-0339基因表达的蛋白具有促进炎性反应的作用。综上所述,本研究应用非标记定量蛋白质组学(Label-Free)方法对牛支原体强弱菌株的分泌蛋白质组进行分离和鉴定,初步揭示了牛支原体强弱菌株分泌蛋白组及其差异蛋白。对8种分泌蛋白进行原核表达和多克隆抗体制备及生物功能探究,发现重组蛋白rMbovP339对牛巨噬细胞BoMac的炎性反应具有促进作用。