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目的:观察HMGB1-Abox高表达对肠上皮细胞株SW480和单核细胞株THP-1中LPS/TLR4的影响,为以HMGB1-Abox为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法:㈠LPS对SW480细胞HMGB1表达的影响实验分组如下:①对照组:SW480+0ng/ml LPS;②实验组1:SW480+100ng/ml LPS;③实验组2:SW480+1000ng/ml LPS;④实验组3:SW480+10000ng/ml LPS;培养SW480细胞至对数生长期,给予不同浓度LPS分别作用12h、24h收集细胞检测HMGB1的表达(重复3次)。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达细胞株⑴HMGB1-Abox重组真核质粒的构建及鉴定①在GeneBank中查找人HMGB1-A box基因序列,由公司基因合成。②将合成的HMGB1-A box基因插入到pEGFP-N1载体,构建重组质粒。扩增及提取重组质粒,鉴定方法采用酶切和测序。⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达采用阳脂质体转染技术将pEGFP-N1-HMGB1-A box转染SW480细胞,分别观察有无绿色荧光及荧光强度,并收集细胞检测HMGB1-Abox mRNA表达水平(重复3次)。㈢HMGB1-A box高表达和EP对SW480肠上皮细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子的影响实验分组:①对照组:SW480细胞;②EP组:SW480细胞+EP;③空质粒组:转染空质粒的SW480细胞;④Abox质粒组:转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞上述各组再分为LPS及无LPS处理。(EP为5mM,预处理1h,LPS为1000ng/ml,24h),24h后收集细胞培养上清及细胞(重复3次)。㈣EP及HMGB1-A box高表达SW480细胞与THP-1细胞共培养对THP-1细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响用Transwell系统将SW480细胞和THP-1细胞共培养,实验分组:①对照组:SW480细胞+THP-1;②EP组:SW480细胞+EP+THP-1;③空质粒组:转染空质粒的SW480细胞+THP-1;④Abox质粒组:转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞+THP-1上述各组再分为LPS处理及无LPS处理。(EP为5mM,预处理1h,LPS为1000ng/ml,24h),24h后收集细胞培养上清及细胞(重复3次)。㈤检测方法:①实时荧光定量PCR方法检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达。②免疫印迹方法检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白表达。③双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中HMGB1含量。④固相多重双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。结果:㈠LPS对SW480细胞内HMGB1的影响:①不同浓度的LPS处理SW480细胞12h,SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高,其中LPS浓度为100ng/ml组与对照组相比,有统计学差异(P<0.05);不同浓度LPS处理24h时,SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高,其中1000ng/ml组HMGB1mRNA表达与对照组相比,有统计学差异(P<0.01),而其它组间HMGB1mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。②LPS处理SW480细胞不同时间,24h组HMGB1mRNA表达均高于12h组,但只有1000ng/ml组有统计学意义(P<0.05),故本实验选用LPS的处理时间为24h,作用浓度为1000ng/ml。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达SW480细胞⑴HMGB1-Abox重组真核表达质粒的构建及鉴定成功构建pEGFP-N1-HMGB1-A box重组表达质粒,酶切后琼脂糖凝胶电泳显示两条带,其分子量大小与预期大小相同。测序分析显示插入片段与PubMed基因文库(GenBank Accession: NM002128.4)中的HMGB1-A box基因序列相似性为100%。⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达HMGB1-A box重组质粒转染SW480细胞后,在荧光显微镜下出现绿色荧光。细胞内HMGB1-Abox mRNA表达高于未转染组(P<0.01),提示转染成功。㈢EP和HMGB1-A box高表达对SW480细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响⑴各组细胞内HMGB1mRNA及蛋白表达:HMGB1mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05),在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组(P<0.05),后3组之间无统计差异(P>0.05);除EP组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。⑵各组细胞内TLR4mRNA及蛋白的表达:TLR4mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05),在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组(P<0.05),后3组之间无统计差异(P>0.05);除EP组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。⑶各组细胞内MyD88蛋白的表达:MyD88mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05),在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组(P<0.05),后3组之间无统计差异(P>0.05);除EP组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。⑷各组细胞内pNF-κB p65蛋白的表达:pNF-κBp65蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05),在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组(P<0.05),后3组之间无统计差异(P>0.05);除EP组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。⑸各组细胞培养上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:①HMGB1的含量在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05),在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组(P<0.05),后3组之间无统计差异(P>0.05);除EP组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.01)。②IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05),在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组(P<0.05,0.01),后3组之间无统计差异(P>0.05);除EP组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。㈣EP及HMGB1-A box高表达SW480细胞与THP-1细胞共培养对THP-1细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响⑴各组细胞内HMGB1mRNA及蛋白表达:THP-1细胞与SW480细胞共培养后,THP-1细胞中HMGB1mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05);在LPS处理组HMGB1mRNA表达在EP组显著低于对照组和空质粒组(P<0.05),Abox转染组显著低于空质粒组(P<0.05),HMGB1蛋白表达在EP组和A box转染组显著低于对照组和空质粒组(P<0.05);除EP组和Abox转染组,各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。⑵各组细胞内TLR4mRNA及蛋白的表达:THP-1细胞与SW480细胞共培养后,THP-1细胞中TLR4mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05);在LPS处理组TLR4mRNA表达在EP组和A box转染组显著低于对照组和和空质粒组(P<0.05),TLR4蛋白表达在EP组显著低于对照组和空质粒组(P<0.01),A box转染组显著低于空质粒组(P<0.05);除EP组和Abox转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)⑶各组细胞内MyD88mRNA及蛋白的表达:THP-1细胞与SW480细胞共培养后,THP-1细胞中MyD88mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05);在LPS处理组MyD88mRNA和蛋白表达在EP组和A box转染组显著低于对照组和空质粒组(P<0.05);除EP组和A box转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05,0.01)。⑷各组细胞内pNF-κB p65蛋白的表达:THP-1细胞与SW480细胞共培养后,THP-1细胞中pNF-κBp65蛋白表达在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05);在LPS处理组pNF-κBp65蛋白表达在EP组和A box转染组显著低于对照组(P<0.01);A box转染组显著低于空质粒组(P<0.01),除EP组和Abox转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.05)。⑸各组细胞培养上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:①THP-1细胞与SW480细胞共培养后,培养上清中HMGB1含量在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05);在LPS处理组HMGB1含量在EP组和Abox转染组显著低于对照组和空质粒组(P<<0.05,0.01);除EP组和Abox转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P<0.01)。②THP-1细胞与SW480细胞共培养后,培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在无LPS处理组之间无统计学差异(P>0.05);在LPS处理组它们的含量在EP组和A box转染组显著低于对照组和和空质粒组(P<0.01);除EP组和A box转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组(P>0.05,P<0.01)。结论:1、LPS可激活SW480和THP-1细胞TLR4信号通路及上调HMGB1的表达,促进促炎细胞因子分泌。2、HMGB1-Abox高表达SW480与THP-1细胞共培养可抑制后者表达和分泌HMGB1及并抑制LPS/TLR4信号通路和促炎细胞因子分泌。3、EP可以抑制SW480和THP-1细胞HMGB1的表达和分泌,并抑制LPS/TLR4信号通路及促炎细胞因子分泌。