论文部分内容阅读
2009年新型甲型H1N1流感病毒席卷全球,导致大量人员死亡,给人类的生命健康带来严重威胁。流感病毒具有易突变和基因重排的特征,继而逃逸宿主免疫抵抗,并引起传染性和致病力增强的潜在危险；新型甲流病毒在易感人群中诱发严重的肺部疾病及并发症,例如急性肺损伤,甚至导致死亡。因此,关注新出现的流感病毒株诱导的宿主免疫反应和调控机制以及探寻可能的免疫治疗靶点显得尤为迫切需要。本研究从临床咽拭子样品中分离得到2009年新型甲型H1N1流感病毒株,A/Nanjing/108/2009,分别观察其感染巨噬细胞、支气管上皮细胞诱导宿主免疫反应以及MAPK和PI3K/Akt信号通路的调控作用,明确Forkhead转录因子蛋白磷酸化是否参与病毒蛋白NS1通过PI3K/Akt信号通路引起人支气管上皮细胞凋亡过程；为探索H1N1感染致病过程的新免疫调控靶点提供思路,本研究在前人研究基础之上,也进一步探讨了前B细胞集落增强因子(PBEF, pre-B cellcolony-enhancing factor)作为急性肺损伤(ALI, acute lung injury)生物标志在新型甲型H1N1流感病毒诱导肺微血管内皮功能失调病理过程中的作用机制。研究结果：1、经测序结果与代表性新型甲型H1N1流感病毒株比较,结合新型甲型H1N1遗传特征,证实临床样品分离病毒株属于新型甲型H1N1流感病毒。2、新型甲型H1N1感染激活MAPK, ERK和JNK磷酸化,并介导调控炎症反应、细胞凋亡和抗病毒反应。在巨噬细胞受感染诱导后,炎症因子IL-6和IL-8诱导表达上调依赖于ERK激活,JNK激活也部分参与IL-6诱导上调,而抑制JNK能进一步增加IL-8、IL-1β表达；趋化因子CCL-5和GCSF诱导上调过程都依赖于ERK激活,前者还依赖JNK激活；抗炎因子IL-10的诱导过程只观察到对ERK激活的依赖。NFkB信号途径与MAPK激酶通路在新型甲型H1N1介导免疫反应时存在相互作用,ERK激酶化激活过程受到NFkB信号诱导调控,不受IKK作用；相反,ERK和JNK磷酸化激活都促进NFkB/IKK通路信号传导,p38没有观察到与NFkB/IKK通路间的相互作用。在新型甲型H1N1诱导巨噬细胞凋亡过程中,凋亡促进因子TNF-α, FasL和TRAIL中,前两者出现显著的诱导上调。新型甲型H1N1诱导巨噬细胞抗病毒因子IFN-β以及其诱导蛋白Mx和2’5’-OAS上调过程都主要依赖ERK磷酸化,JNK激活也发挥一定作用。3、新型甲型H1N1感染HBE也诱导抗病毒反应、炎症因子和细胞凋亡因子表达上调。Akt抑制剂阻断PI3K/Akt信号传导,上调HBE表达IL-8和FasL;而MAPK成员JNK磷酸化被抑制时,下调IFN-β、IL-1β、IL-6、IP-10的表达,提示PI3K/Akt和MAPK两条途径都参与病毒感染诱导的HBE免疫反应。PI3K/Akt信号传导通路下游分子Forkhead转录因子家族中FoxO1在感染后期与Akt同步出现去磷酸化,参与病毒NS1蛋白介导HBE细胞凋亡。4、PBEF被认为是ALI生物标志物,新型甲型H1N1感染诱导人肺微血管内皮细胞表达PBEF上调,应用PBEF siRNA干扰抑制PBEF时,发现其能下调IFN-β、TNF-α、IL-1β、 IL-6、IL-8以及IP-10等炎症因子,并通过下调FasL表达而减少内皮细胞凋亡；同时,抑制PBEF能改善病毒诱导的体外肺微血管内皮通透性增加,进一步观察发现抑制PBEF能降低血管内皮细胞间关键粘附分子钙粘蛋白VE-cadherin磷酸化水平,此外,对其上游影响因子VEGF和受体VEGFR表达也起到抑制功能。可以认为PBEF也是一种通透性增加因子(PIF),在病毒引起的内皮功能失调中发挥作用。结论：新型甲型H1N1流感病毒感染支气管上皮细胞、肺微血管内皮细胞、巨噬细胞能诱导不同程度的炎症、细胞凋亡和抗病毒等免疫反应,而MAPK激酶家族和PI3K/Akt信号途径以及NFkB/IKK转录途径在诱导过程中起到不同的调节功能。流感病毒NS1蛋白通过 FoxO1蛋白在感染后期去磷酸化介导了Fas/FasL胞外凋亡途径,促进感染细胞凋亡,利于病毒颗粒释放。PBEF是一种新的PIF因子,能上调VEGF/VEGFR表达,介导肺微血管内皮细胞间关键粘附分子VE-cadherin磷酸化增加,从而参与新型甲型H1N1流感病毒诱导的肺微血管内皮屏障功能失调；同时,PBEF也参与病毒诱导的炎症和细胞凋亡等免疫反应,提示PBEF可能是新型甲型H1N1流感病毒重症患者潜在的免疫治疗靶点。