【摘 要】
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研究背景淀粉样脑血管病（cerebral amyloid angiopathy,CAA）是脑小血管病（cerebral small vessel disease,CSVD）的主要类型之一,累及毛细血管时称为毛细血管CAA,主要是Aβ-淀粉样蛋白（amyloid-β protein,Aβ）沉积所致。周细胞（Pericyte）是血管壁内细胞,在脑淋巴系统清除Aβ过程中发挥关键的调控作用,当周细胞发生损
【基金项目】
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广州市科技计划项目（201803010010）； 南方医科大学第三附属医院院长基金项目（YM2021002）；
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研究背景淀粉样脑血管病（cerebral amyloid angiopathy,CAA）是脑小血管病（cerebral small vessel disease,CSVD）的主要类型之一,累及毛细血管时称为毛细血管CAA,主要是Aβ-淀粉样蛋白（amyloid-β protein,Aβ）沉积所致。周细胞（Pericyte）是血管壁内细胞,在脑淋巴系统清除Aβ过程中发挥关键的调控作用,当周细胞发生损伤时可造成脑内Aβ清除障碍,导致Aβ沉积,是CAA的关键机制。NLRP3炎症小体（NLRP3 Inflammasome）能介导炎症反应和细胞凋亡（apoptosis）,与自噬（autophagy）之间有着密切的相互调控作用。自噬受到抑制时,炎症小体能过度激活,引发强烈的炎症反应对机体造成损伤,在脑血管病、神经退行性变与衰老等有关的疾病发生发展中发挥重要的作用。莱菔硫烷（Sulforaphane,SFN）是一种异硫氰酸盐,具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抑制Tau蛋白过度磷酸化等功能,对神经系统退行性病变具有显著保护作用。综上所述,我们推测当脑周细胞持续受到Aβ刺激时,可能会发生自噬和NLRP3炎症小体的过度活化,引发一系列的炎症级联反应导致脑周细胞死亡,致使脑内Aβ无法有效清除,进一步推动CAA的发生。SFN可能在这机制中起到抑制自噬和抗炎作用,从而达到保护周细胞的效果。研究目的本研究的目的旨在探讨Aβ对原代周细胞的毒性作用,及自噬、NLRP3炎症小体在其病理机制中的作用,以及SFN的保护作用。研究方法1、免疫荧光法鉴定原代周细胞的纯度。2、CCK-8法及LDH法检测原代周细胞的细胞活性和毒性作用。3、qPCR检测原代周细胞的NLRP3炎症小体RNA表达。4、免疫印迹分析（Western blot analysis,WB）检测原代周细胞的NLRP3和自噬蛋白的表达水平。5、流式细胞术检测原代周细胞的凋亡率。研究结果1、免疫荧光鉴定显示原代周细胞随着传代次数增加纯度逐渐升高。2、免疫荧光鉴定结果显示原代周细胞种在用鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被的Transwell板上比无胶原包被的细胞纯度高。3、CCK-8结果显示Aβ25-35对原代周细胞的活性未见明显影响;LDH结果显示Aβ25-35对原代周细胞的细胞活性有“Hormesis”效应。4、CCK-8结果显示SFN对原代周细胞活性的影响有“Hormesis”效应,即低剂量时激活,高剂量时抑制。5、qPCR结果显示SFN能抑制Aβ25-35刺激的原代周细胞NLRP3、ASC、GSDMD的RNA表达,WB结果显示SFN能抑制Aβ25-35刺激的原代周细胞NLRP3的蛋白表达水平。6、WB结果显示Aβ25-35能增加原代周细胞自噬特异性蛋白LC-3Ⅱ表达,呈时间依赖性,随着作用时间延长而降解。SFN能逆转Aβ25-35刺激的原代周细胞LC-3Ⅱ蛋白的表达升高和P62蛋白的降低。7、流式结果显示Aβ25-35能够诱导原代周细胞凋亡率升高,SFN能起到抑制作用。结论1、Aβ25-35对原代周细胞毒性作用有“Hormesis”效应;而且SFN对原代周细胞也具有“Hormesis”效应,即双重影响。2、Aβ25-35能够刺激原代周细胞NLRP3炎症小体的激活和增强自噬活动并呈时间依赖性;SFN能够逆转Aβ25-35诱导的NLRP3炎症小体活化继而介导的自噬活化;SFN能够通过抑制自噬和NLRP3炎症小体激活逆转Aβ25-35诱导的原代周细胞凋亡。
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