猪伪狂犬病（Pesudorabies virus,PRV）是二类动物疫病,在我国大面积流行,目前主要是用Bartha K61株相关疫苗进行预防免疫。但越来越多的报道指出该疫苗免疫猪场出现PRV发病或猪血清转阳的情况。为解决当前疫情,研发基于本土变异毒株的PRV基因缺失疫苗,进而控制PRV感染态势是当前的主要策略。本试验首先通过改造Puc57质粒,加入TK基因上下游同源臂和红色荧光表达盒,成功构建了可表达红色荧光的含有TK同源臂的Puc57-TK-RED转移载体。随后将实验室已构建的PRV XJ gE/gI双基因缺失株病毒基因组DNA和转移载体质粒DNA共转染细胞,通过同源重组的方法缺失部分TK基因。依靠红色荧光标签,通过空斑实验重复筛选和纯化缺失病毒株。纯化后传代20代,通过特异性gE,gB,TK基因PCR检测纯化病毒株,并结合荧光倒置显微镜下观察的缺失病毒株细胞病变结果,综合判定本次试验成功构建了一株带有绿色荧光和红色荧光标签的PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失病毒株。PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株传代稳定性鉴定结果表明,缺失株传代过程稳定,没有外源病毒污染,不会因传代导致毒力下降,PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株病毒滴度约为10^7.60TCID50/mL。绘制缺失病毒株一步生长曲线,发现其生长特性与亲本株PRV XJ株,PRV XJ gE/gI双基因缺失株相近。对小鼠试验结果显示,PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株不致死小鼠,具备良好的安全性;免疫原性好,能刺激小鼠产生高效价的中和抗体;攻毒保护试验证实构建的缺失株具备极佳的免疫保护作用。综上,可见PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株可作为优秀的疫苗备选株,对进一步开发新的PRV基因缺失疫苗具有重要意义。