干细胞(stem cells，SC)是一种未充分分化，具有自我复制能力(self-renewing)的、不成熟的多潜能细胞，一定条件下可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段能分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell)。主要从胚胎内细胞群(inner cell mass)中分离、克隆出来的称为胚胎干细胞。如果在体外合适的培养条件下，ES能够分化为内、中、外三个胚层所含各种类型的细胞。但在某些特定的体外培养条件下，还能保持特有的未分化全能状态而无限分裂增殖。当今众多生命科学领域均在涉及研究人胚胎干细胞的特性，主要集中在个体生长发育的生物学研究、疾病发生的相关机理、研究及治疗、组织器官的重塑、再造、移植等方面。尽管如此，在将展开ES细胞的研究工作之前首要解决的问题就是ES细胞如何自我更新的维持条件机理以及如何诱导定向分化的条件，这是ES细胞研究中的关键和难点，也是ES细胞得以发挥前景作用的前提。　　 Oct4是目前研究较多的有关哺乳动物胚胎发育过程中的一个关键的因子，而且对维持干细胞的未分化状态及多能性可能起着重要的作用。目前多数学者认为Oct4的作用是主要是通过其对下游的靶基因的调控及它们之间的相互作用来实现的。Oct4在调控下游基因表达时发挥着双重功能。其一它可以抑制一些能诱导促使细胞发生分化的基因表达，另一方面却又能激活那些有助于维持细胞多能性的基因的表达。而且Oct4也有多样化的调控方式，它可以通过与下游基因的某些作用位点结合直接调控基因的表达，也可以通过与其它转录因子在蛋白水平相互调节作用来影响基因的表达。因此要了解Oct4是如何调控维持细胞的全能/多能性状态，首先要了解Oct4的靶基因及其如何通过对靶向基因的转录调控而发挥作用的。　　 microRNA是一种小分子RNA，最近的研究发现，microRNAs(miRNAs)在干细胞的多/全能性维持和分化过程中也具有重要的作用。miR-302是一簇包括8个miRNA(miR302、302b*、302c、302c*、302a、302a*、302d、367)的基因，位于4号染色体上，是胚胎干细胞和胚胎癌细胞所特有的。它们有共同的前体，高度同源，其差别主要在3’端结构。一些研究表明，miR-302高表达于多能细胞，而在分化的细胞中表达明显下降。另有研究表明miRNA-302启动子区域可能存在Oct4等多能转录因子的结合位点，Oct4等多能因子能上调miRNA-302启动子活性，故推断miR-302可能与胚胎干细胞和胚胎癌细胞的多能性及自我更新有关，miR-302和Oct4等调控因子共同参与干细胞多能性维持的调节网络。　　 本课题基于在干细胞中Oct4与miRNAs之间可能存在相互调控作用的观点，采用real-time PCR及荧光素酶报告系统的实验方法，检测P19细胞中Oct4的RNA干扰后Oct4及miR-302表达量的变化，对二者相关性进行分析；之后采用染色质免疫沉淀技术(CHIP)分析Oct4是否能募集到miR-302启动子上；并通过构建的PGL3-302-mut突变基因质粒比对PGL3-P-miR302启动子质粒与pEGFP-N1-Oct4质粒共同转染293T细胞(不表达Oct4及miR-302)，来验证miR-302启动子是否是Oct4的靶基因，可以结合Oct4并受其调控。进而为阐明P19细胞维持不分化状态的机制提供理论依据。　　 第一部分P19细胞中内源性Oct4表达与miR-302相关性研究　　 目的：对P19细胞中Oct4表达与miR-302相关性进行分析，以证明Oct4表达和miR-302活性在P19细胞多能性的调控中的共同作用。　　 方法：采用荧光半定量real-time PCR方法检测Oct4的RNA干扰后P19细胞中Oct4及miR302的表达量的变化。采用荧光素酶报告基因系统检测转染PGL3-P-miR302启动子质粒后的P19细胞在Oct4 RNA干扰后的Oct4及miR302的表达量的变化。　　 结果：经RNA干扰后的P19细胞中Oct4及miR302的表达量均下降，具有相关性。　　 结论：P19细胞中Oct4及miR302的表达具有相关性，它们可能共同参与P19细胞多能性的调控。　　 第二部分 Oct4与miR-302启动子结合及调节其活性作用的相关研究　　 目的：检测P19细胞中Oct4是否在miR-302启动子上募集。探讨Oct4是否可以结合并对miR-302启动子活性有调节作用。　　 方法：构建PGL3-P-miR302-mut突变启动子荧光素酶报告基因质粒。采用染色质免疫沉淀技术检测Oct4是否在miR-302启动子上募集。应用pEGFP-N1-oct4质粒、及PGL3-P-miR302质粒、PGL3-P-miR302-mut突变启动子质粒共同转染293T细胞，荧光素酶报告基因检测miR-302启动子活性变化验证Oct4是否可以结合miR-302启动子并对其进行调控。　　 结果：成功构建PGL3-P-miR302-mut启动子荧光素酶报告基因质粒。Oct4能在miR302启动子上募集。PGL3-P-miR302-mut启动子活性较PGL3-P-miR302活性在不同Oct4表达量下的变化有差异性。　　 结论：Oct4可能直接与miR302启动子相互作用发挥对其调节作用。miR-302可能是Oct4的靶基因之一。