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因细胞环境的缺失及酶在提取过程中蛋白结构的变化甚至部分变性，细胞外的游离酶催化速率明显低于细胞内水平，如何提高生物体或细胞外酶的催化性能，制备出高效固定化酶，一直是国际生物催化领域研究的热点。传统的酶固定化一直演绎着“酶+载体”的过程，在固定化过程中主要研究集中于载体的种类、性能以及酶在其表面的附着方式，针对于载体表面微观环境的调控研究较少，而酶蛋白存在的微环境直接影响酶的结构及催化过程。
本论文基于酶催化性能与其结构、微环境之间的联系，充分考虑酶微环境的变化对酶催化的影响，分别将纳米技术、细胞生物学、仿生学、微波化学等学科和技术的发展成果引入酶的固定化中，旨在模拟细胞环境，实现酶的高效仿生性固定化，提高酶的催化性能及稳定性，同时，借助大孔和高比表面积的介孔载体，克服细胞内传质困难的弊端。最后将其中的仿生性固定化青霉素酰化酶与膜生物反应器组合，应用于高效酶法制备抗生素中间体6-氨基青霉烷酸的过程中，本论文的主要研究成果如下：
(1)通过对将木瓜蛋白酶与银纳米粒子共同固定化在二氧化硅载体表面的研究，考察了载体表面银纳米粒子的含量对木瓜蛋白酶共价固定化的影响，探讨了不同交联剂共价连接对木瓜蛋白酶固定化的作用。研究结果表明，银纳米粒子能稳定载体表面木瓜蛋白酶的结构与催化性能，当载体的银负载量为3.9％时，木瓜蛋白酶的负载率及相对活力分别为没银负载时的1.17和1.86倍。又以zeta电位测定仪表征了银纳米粒子和木瓜蛋白酶负载前后载体表面zeta电位的变化，证实了银纳米粒子与蛋白之间的静电作用，且通过红外光谱表征了不同载体表面酶蛋白的酰胺Ⅰ和Ⅱ带，分析和证实了银纳米粒子对载体表面酶结构的稳定作用。这是木瓜蛋白酶与Ag/SiO2复合载体之间的纳米效应、络合作用、静电作用的三重作用结果。
(2)制备了介孔泡沫硅(Mesocellular Siliceous Foams，MCFs)，在室温下将青霉素G酰化酶固定化在MCFs的孔道中。青霉素G酰化酶的加酶量为60 mg/g MCFs，经12 h的固定化，负载率达94.10％，固定化酶的相对活力高达121.43％，湿酶活力为1120.22 u/g。与游离酶相比，青霉素G酰化酶经固定化后酶蛋白部分复性，活性位点数略有提高，作用的pH和温度范围得到了拓宽，表观亲和力亦有提高。固定化酶存储稳定性显著增强，4℃保存近一个月，残留活力高达90％。
(3)通过分析体外酶催化与体内酶催化的微环境差别，在酶固定化的同时加入大分子试剂，在孔道内模拟细胞拥挤环境，明显提高了固定化酶的活力及稳定性。加入Dex10k或BSA的大分子试剂后，大分子与介孔共同构建的模拟细胞环境中固定化酶的活力提高到无大分子拥挤时的1.26倍以上。50℃条件下热处理1小时后游离酶活力基本完全丧失，处理6小时后介孔中的共价固定化酶保持了初始活力的32.0％，而BSA和Dex10k参与构建模拟细胞环境的仿生性固定化青霉素酰化酶的活力仍分别保留了初始活力的53.0％和51.5％。由于因拥挤效应和大分子的非共价作用力共同成功实现了细胞环境的模拟，较好地稳定了酶蛋白结构，且催化过程中模拟细胞环境有利于底物的富集和酶的催化。
(4)利用微波辐射加速了酶在介孔材料MCFs中的固定化。考察了微波辐射时间和功率对酶固定化的影响。研究发现，木瓜蛋白酶和青霉素酰化酶分别只需80s和140s即能实现酶在介孔中的吸附及固定化平衡，每克载体的木瓜蛋白酶负载量达到984.1 mg，是目前文献报道最高水平的1.73倍，也是本研究中非微波辅助方法的1.26倍。微波辐射组合冰浴低温系统，提高了酶在介孔中的固定化效率，且固定化酶的活力及稳定性较普通方法有明显上升。微波辅助固定化的木瓜蛋白酶在80℃下的半衰期为17h，为非微波辅助方法固定化酶(t0.5=3.3 h)的5.21倍。在利用微波低温辐射进行青霉素酰化酶的共价仿生固定化研究中，借助红外光谱证实了酶与载体的共价连接，考察了微波辅助仿生性固定化酶的性能。BSA与Dex10k拥挤下微波辅助构建的仿生固定化青霉素酰化酶的比活力分别达到112.7 U/mg和85.3 U/mg，是介孔中固定化青霉素酰化酶的1.55和1.17倍。冰箱中放置35天后，仿生固定化酶的剩余活力仍然高达88.5％，微波辅助构建的仿生固定化青霉素酰化酶的贮存稳定性较游离酶及介孔中的固定化酶有较大改善。
(5)将小分子封闭技术引入酶的共价固定化中，通过小分子封闭固定化酶载体表面未反应的活化基团，消除其在固定化酶使用过程中对酶蛋白结构的损伤和催化性能的破坏。研究发现，乙醇对固定化脂肪酶中的封闭效果最佳，而在固定化青霉素酰化酶中氨基酸封闭效果较好。在50℃下加热5h后，未经过醇类分子封闭多余活性基团的固定化酶剩余活力只有初始条件下的16.1％，而经过乙醇封闭的固定化酶其剩余活力达到初始条件下的60.6％，为未封闭的3.8倍。通过甘氨酸封闭的固定化青霉素酰化酶在50℃下加热25h后，活力保持了初始状态下的87.9％，而未封闭的固定化酶在此温度下加热6h后剩余活力只有初始状态的39.6％。通过几类醇类小分子和氨基酸小分子封闭的结果比较可以看出，合适小分子封闭载体表面的多余的活性基团，可改善载体表面的微环境，从而提高固定化酶的热稳定性。
(6)应用膜生物反应器，初步研究了将仿生固定化青霉素酰化酶用于半合成抗生素工业关键中间体-6-氨基青霉烷酸(6-APA)的酶法制备工艺，降低了酶法制备6-APA的生产成本，分析计算显示1Kg6-APA的生产成本降低40.86元，降低幅度约为该产品目前市场价格的13％左右。