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目的: 本课题以人源性白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作为模型细胞因子，成功构建人IL-2、TNF-α基因经IRES功能元件串联的重组质粒IL-2-IRES-TNF-α，将其转染人源性胚胎肾细胞HEK293中实现成功表达，并检测重组质粒转染细胞培养上清中IL-2和TNF-α对AGS胃癌细胞生长抑制作用。 方法: 1、目的基因片段的获取 1.1引物设计合成根据GenBank数据库上发表的hIL-2和TNF-α基因mRNA序列设计引物。 1.2总RNA提取将贴壁细胞研磨和匀浆，应用Trizol法提取贴壁细胞中总RNA，将产物快速进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，以确定RNA的纯度和浓度。 1.3PCR扩增IL-2、TNF-α基因利用引物将总RNA反转录为DNA，再以纯化DNA质粒为模板，用 IL-2、TNF-α基因特异性上下游引物将cDNA扩增为DNA，将产物快速进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像分析系统鉴定和纯化。 2、重组质粒IL-2-IRES-TNF-α的构建 2.1重组质粒的构建设计从贴壁细胞中提取RNA，通过实时荧光定量（RT-PCR）法获取目的基因，按照顺序加入间隔序列IRES，形成串联基因IL-2-IRES-TNF-α。hIL-2和TNF-α基因进行扩增、回收，将目的基因片段与GV219载体连接，分别加入XhoI和EcoRI酶切位点，使用T4连接酶将酶切产物回收在16℃酶连过夜，连接产物转化感受态细胞DH5α中，双酶切产物克隆到载体GV219中，挑取阳性克隆经PCR鉴定、测序，获得重组质粒真核表达载体。PCR扩增条件对阳性克隆进行鉴定，并对筛选到的阳性克隆进行测序。 2.2重组质粒的鉴定将获得的重组质粒用XhoI和EcoRI酶切位点进行双酶切鉴定，所得酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，检测重组质粒经双酶切后，片段是否与预期大小一致。 3、重组质粒IL-2-IRES-TNF-α在HEK293细胞中的表达检测 3.1HEK293细胞的转染使用罗氏转染方法实现重组质粒IL-2-IRES-TNF-α在HEK293细胞中瞬时成功表达。 3.2RT-PCR检测重组质粒IL-2-IRES-TNF-α在HEK293细胞中的转录水平表达。 3.3Western-Blot检测HEK293细胞中重组质粒IL-2-IRES-TNF-α的翻译水平表达。 3.4ELISA检测重组质粒转染细胞培养上清液中IL-2、TNF-α的分泌水平。 4、重组质粒转染HEK293细胞其细胞上清的生物活性鉴定 采用CCK-8法检测转染细胞上清液中IL-2和TNF-α对AGS胃癌细胞生长抑制作用。 结果: 1、串联重组质粒IL-2-IRES-TNF-α的构建 经RT-PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳图中明确的显示特异性扩增条带，与预期大小一致。 2、重组质粒IL-2-IRES-TNF-α在HEK293细胞表达 2.1应用RT-PCR法检测结果发现，重组质粒组中IL-2 mRNA的表达随着时间递增呈持续升高的趋势，TNF-αmRNA的表达在12小时达到高峰，这种升高趋势一直持续到24小时，随即在48小时表达有所下降，但仍高于对照组。 2.2Western blot检测证实蛋白条带分别在36kDa、17kDa和18kDa的位置清楚可见。稳定转染后HEK293细胞中检测到IL-2-IRES-TNF-α在蛋白表达，而对照组的质粒转染后细胞48小时后则没有相应的条带，表明所构建的真核表达载体在HEK293细胞内表达。IL-2和TNF-α相对蛋白质含量在24小时内IL-2相对蛋白质含量略高于TNF-α，随即在48小时后IL-2相对蛋白质含量逐渐降低而TNF-α增高。2.3ELISA检测证实重组质粒实现可分泌性表达，随时间延长转染细胞培养上清液中IL-2的OD450随之增加；转染细胞培养上清液中TNF-α随时间的增加OD450而降低，三组计量资料的比较，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验方法，P<0.05表示差异有统计学意义。 3、通过CCK-8法检测证实转染HEK293细胞培养上清中IL-2和TNF-α具有显著杀伤肿瘤细胞及生长抑制作用。 结论: 1、成功构建IL-2-IRES-TNF-α串联重组质粒。 2、重组质粒IL-2-IRES-TNF-α在人源性HEK293细胞中能成功表达。 3、研究证实了重组质粒hIL-2-IRES-TNF-α转染HEK293细胞培养上清中的IL-2和TNF-α，具有协同抑制AGS胃癌细胞生长的作用，为开发重组人源IL-2、TNF-α细胞因子的临床治疗及药物制备奠定基础。