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放射治疗是肿瘤治疗的重要手段之一,由于肿瘤细胞的异质性,其对放、化疗的反应相差悬殊。肿瘤基因治疗是一门遗传学治疗技术,通过在肿瘤细胞中加入具备正常功能的基因,以提供新的、正确的功能。它的基本内容包括治疗的靶基因、表达载体和治疗策略。重组腺病毒-p53制剂是中国第一个进入临床实验的基因治疗I类新药。其与放射治疗联合在II期和III期临床验证中显示对肺癌、头颈部鳞瘤、喉癌、鼻咽癌等的明显肿瘤治疗作用。
恶性黑色素瘤具有早期高度转移潜能,尽管常常检测到野生型p53基因,却对常规放化疗高度抗拒,因此,寻求有效治疗黑色素瘤的方法十分重要。本文就如何将放射治疗与基因治疗有机结合、外源性p53对不同p53状态的黑色素瘤细胞生长抑制和辐射增敏作用,以及外源性P53蛋白对不同传能线密度(LET)射线辐照诱导肿瘤细胞死亡途径的影响做了一些粗浅研究。
首先,采用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导人野生型p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的黑色素瘤细胞系A375(wt p53)和WM983a(mu p53),RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率。用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP(绿色荧光蛋白)作为对照。结果显示1 Gy X-射线辐照可明显增加AdCMV-p53对A375和WM983a细胞系的基因转导效率,转导的外源性野生型P53可在两种细胞中高效表达,并诱导细胞周期Gl期阻滞;单纯转导p53对A375(wtp53)细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应,但可部分诱导WM983a(mup53)细胞凋亡;而转导p53基因48小时后给予X-射线辐射,两种细胞克隆存活率较其对照组均明显减低;外源性p53基因对WM983a(mup53)细胞的辐射增敏作用较A375(wtp53)细胞明显。这些结果表明小剂量辐射既可有效增加腺病毒介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用。而且,外源性野生型p53可明显增加黑色素瘤细胞系A375(wtp53)和WM983a(mu p53)的辐射敏感性。提示p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗恶性黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制剂用量过大而给病人造成的毒副作用。
其次,观察了外源性P53蛋白对不同传能线密度(LET)射线辐照诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的影响,并探讨其可能的机理。人黑色素瘤细胞系A375(wild-typep53)经携带人野生型p53基因的腺病毒载体(AdCMV-p53)感染后分别给予X-射线和碳离子束照射,采用克隆形成法测定细胞辐射敏感性,Hoechst33258和吖啶橙-溴化乙锭双染,荧光显微镜下观察细胞凋亡和死亡。结果发现:(1)高LET射线辐照时,A375细胞和转导人野生型p53基因的A375细胞(A375/p53)的辐射敏感性没有明显差异;(2)虽然辐射诱导细胞凋亡比例的增加依赖于LET,但是无论高LET或低LET,外源性P53蛋白均可有效诱导细胞凋亡;(3)高LET射线辐照时,A375细胞的坏死细胞明显高于A375/p53细胞。尽管高LET射线辐射对A375和A375/p53细胞的存活无明显影响,但是对细胞凋亡的诱导却部分依赖于P53蛋白的功能,提示P53蛋白可能在调节细胞死亡类型中发挥重要作用。这对临床应用高LET射线辐射联合p53基因治疗恶性黑色素瘤有一定参考意义。