论文部分内容阅读
目的:骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一种以红系、粒系或巨核系等一系或多系髓系细胞克隆性增殖为主的恶性血液学疾病。其中经典的三类MPN疾病包括原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)、原发性骨髓纤维化(PMF)。这三种疾病的临床表现比较相似,可以相互转化,增加了临床诊断的复杂性。原发性血小板增多症(ET)是发病率最高的一种MPN疾病,其血液学特点表现为骨髓中巨核细胞异常增生导致外周血中血小板一直升高。JAK2、MPL、CALR基因突变均可导致ET的发生。JAK2及MPL导致ET发生的分子机制较为清楚,但是CALR突变导致ET的分子机制还尚不清楚。近期研究认为MPL-JAK2-STA T通路介导了ET的发生,然而此机制无法解释CALR突变产生的巨核系过度增殖而粒系数量基本正常这一现象,为此我们认为可能存在新的机制参与CALR突变致ET的过程。经过前期工作我们发现PDGFRβ可能是介导CALR突变致ET发生的一个关键分子。本研究中我们将通过构建CALR突变人巨核细胞株模型即UT-7/EPO,观察PDGFRβ活性被抑制前后CALR突变促细胞增殖的影响,并初步探讨PDGFRβ介导的CALR突变促巨核系恶性增殖的机制,即从细胞水平进行PDGFRβ的功能验证。该研究将有助于提高CALR突变致ET发生机制的认识,并为精准治疗ET提供靶点。方法:1.研究PDGFRβ介导CALR突变促巨核系恶性增殖的作用选用UT-7/EPO细胞作为本研究的细胞模型,这种细胞系的实验分组设计:CALR type1突变组、CALR type2突变组、CALR野生组及空表达载体组,分别命名为CALR-MT1、CALR-MT2、CALR-WT、MSCV。其中CALR-MT1与CALR-MT2均为实验组,CALR-WT为阴性对照组,MSCV为空白对照组。构建慢病毒重组表达载体p CDH1-MSCV-MCS1-T2A-cop GFP,包括CALR-MT1、CALR-MT2及CALR-WT。各表达质粒即CALR-MT1、CALR-MT2、CALR-WT、MSCV分别与包装质粒p PACKH1(包括gag,rev,vsv)按一定比例通过脂质体lipo2000共转染293T细胞(最好选用15代以内的细胞株),转染后48h,使用激光共聚焦显微镜来观察GFP的表达情况,收取转染后48h慢病毒悬液,0.45μM滤器过滤,分装备用。获得慢病毒颗粒后按最适比例分别感染UT-7/EPO细胞,72h激光共聚焦显微镜观察GFP表达状况。扩大培养感染的细胞株,采用流式细胞仪(FACS)分选GFP阳性的克隆细胞,RT-PCR及Western bolt检测细胞中目的基因的表达,建立及保存稳定细胞株。实验分两组平行培养即PDGFRβ未抑制组和PDGFRβ抑制组。PDGFRβ抑制组选用PDGFRβ特异小分子化学抑制剂AG-1295进行抑制。具体方法为:PDGFRβ抑制组中加入含AG-1295抑制剂的培养基(无EPO的10%FBS的RPMI 1640)对各组UT-7/EPO细胞进行培养,收集各组不同时间点(0d、2d、4d、6d、8d)的细胞,用CCK-8方法检测细胞增殖情况;PDGFRβ未抑制组与PDGFRβ抑制组同时培养,相同时间点(0d、2d、4d、6d、8d)收集细胞,用CCK-8方法检测细胞增殖情况。每组实验需重复3遍,统计并比较每组同一时刻的抑制前后细胞增殖情况。2.初步探讨PDGFRβ介导CALR突变促巨核系恶性增殖机制分别收集CALR突变的UT-7/EPO细胞及阴性对照细胞,提取蛋白上清,PBS洗涤两次,裂解细胞并提取总蛋白,蛋白定量,Simple Western法分析磷酸化PI3K蛋白、磷酸化Akt蛋白表达水平,PI3K蛋白、Akt蛋白非磷酸化表达水平。结果:1.PDGFRβ未抑制组(0μmol/L)中CALR-type1、CALR-type2呈现不依赖EPO增殖,而CALR-WT野生型组、MSCV空载体组细胞及UT-7/EPO空白细胞组在无EPO的情况下并没有呈现增殖变化;但经20μmol/L和30μmol/L AG-1295抑制PDGFRβ后各组细胞增殖呈现显著受抑,且在第4d时PDGFRβ未抑制组和PDGFRβ抑制后的各组间细胞增殖程度有显著的统计学差异(P<0.05)。2.PDGFRβ未抑制组(0μmol/L)中CALR-type1、CALR-type2与CALR-WT野生型组相比AKT(Thr 308)磷酸化、p44/p42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr 204)磷酸化都没有显著差异,20μmol/LAG-1295的PDGFRβ抑制组中CALR-type1、CALR-type2与CALR-WT野生型组相比AKT磷酸化、ERK磷酸化也都没有显著差异;PDGFRβ未抑制组各组细胞与20μmol/LAG-1295的PDGFRβ抑制组的各组细胞相比AKT(Thr 308)磷酸化、p44/p42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr 204)磷酸化没有显著差异。结论:野生CALR的UT-7/EPO细胞在无EPO的条件下不能正常增殖,而突变CALR的UT-7/EPO细胞在无EPO的条件下可以增殖,提示PDGFRβ可能参与了CALR突变促进细胞增殖的过程;同时,PDGFRβ的抑制剂AG-1295可以抑制CALR突变的UT-7/EPO细胞的增殖能力,提示PDGFRβ参与了CALR突变促细胞增殖过程,为CALR突变体促细胞增殖的另外一个机制。