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甲氨蝶呤(MTX)临床主要用于小儿白血病、骨肉瘤、绒癌、乳腺癌等癌症的治疗,也可用于银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗。其不良反应包括骨髓抑制、黏膜溃疡和肾功能损伤等。MTX主要通过肾脏排泄,大部分药物以原型排出体外。MTX具有肾脏毒性,一旦引起肾脏损伤会进一步延缓排泄,使MTX清除延迟,继而发生更严重的毒副作用,甚至引起患者死亡。CPG2是一种细菌酶,能迅速的将MTX代谢为两个非活性代谢产物:谷氨酸和2,4-氨基-N-10-甲基碟酸(DAMPA),DAMPA基本无毒性,且主要通过肝脏代谢,为临床上使用甲氨蝶呤的患者提供了一条非肾脏通道的排泄途径,降低大剂量MTX在临床使用时所面临的风险。化疗是肿瘤治疗的重要手段,提高化疗药物的剂量和暴露时间能够提高化疗药物的疗效,但同时化疗药物的毒副作用也随之提高。CPG2能够很好的降解MTX,减轻其毒副作用,但是CPG2降解MTX后会影响其抗肿瘤作用。如果能确定CPG2的一个合适的给药时间点和给药剂量,使MTX能最大程度的发挥抗肿瘤作用,同时又不会产生严重的毒副作用,这样就能够给予高剂量的MTX,提高MTX的抗肿瘤疗效,又能减轻MTX的毒副作用,故本研究的目的是观察CPG2在体内外对MTX抗肿瘤作用的影响,以确定CPG2的合理给药剂量和给药时间,使CPG2给药后即能有效降低MTX的毒性,又尽可能小的影响MTX的抗肿瘤效应,为两药在临床上的联合使用提供参考。在体外实验中,用MTT法,观察CPG2在体外对MTX抑制人乳腺癌MCF-7细胞和人绒毛膜癌JEG-3细胞作用的影响。在动物实验中,用未荷瘤的正常小鼠和裸鼠,观察了CPG2对500mg/kg或800mg/kg剂量下的MTX所致毒性的影响。用小鼠肉瘤S180和人乳腺癌MCF-7移植瘤模型,观察了CPG2对大剂量MTX(HDMTX)抗肿瘤活性和所致毒性的影响。抗肿瘤效应指标包括最大抑制率、瘤重抑制率、瘤体积抑制率和肿瘤分布图等;MTX毒性观察指标主要包括动物存活数量、体重变化、血清肌酐和尿素氮以及病理切片等。体外实验观察到,0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml浓度的MTX作用2h后,对MCF-7和JEG-3细胞均具有良好的抑制作用,呈现浓度依赖性。随着作用时间的延长,低剂量的MTX也显示出较强的抑制作用。MTX暴露2小时后,加入终浓度为0.01、0.1、1、25、50和100U/ml的CPG2,MTX对MCF-7细胞的增生仍具有较强的抑制效应,呈现出良好的浓度依赖性,与MTX单独作用2h的效果相似,提示MTX作用于受试细胞2小时后,给予CPG2不能消除MTX已经产生的细胞杀伤效应,但是能阻值MTX的进一步作用;CPG2的剂量效应关系不明显,0.01和100U/ml产生的效果相似,说明CPG2降解MTX活性较强。在毒性试验中,观察到,对KM小鼠,500mg/kgMTX组,有4只死亡,体重最低值出现在给药后第7天,从第8天开始动物体重逐渐恢复;MTX+24hCPG2组有1只动物死亡,体重最低值出现在给药后第5天,从第6天开始动物体重逐渐恢复;MTX+12hCPG2组未出现动物死亡,动物体重基本没有下降。对裸鼠,800mg/kgMTX组有3只动物死亡,药后第7天体重开始恢复,但恢复较慢,实验结束时仍未完全恢复至给药前,MTX+12hCPG2组未出现裸鼠死亡,体重下降幅度较小,给药后3天开始恢复,给药后7天体重基本恢复至给药前,MTX+16hCPG2组有1只动物死亡,药后第5天裸鼠体重开始恢复,药后第8天体重基本恢复至给药前。对于S180移植瘤模型,第一次实验发现,500mg/kgMTX组的瘤重抑制率为58.5%,MTX给药后16h,给予400U/kgCPG2后瘤重抑制率下降到44.0%,给予100U/kgCPG2后瘤重抑制率为59.0%,与单用MTX类似。MTX组有4只小鼠死亡,小鼠体重下降较多,给予CPG2后,未出现动物死亡,给予CPG2剂量越大体重下降幅度越小,恢复也较快。重复实验也显示出类似结果,对人乳腺癌MCF-7移植瘤实验,800mg/kgMTX组的瘤重抑制率为32.4%,有4只动物死亡;MTX给药后12h,给予200U/kgCPG2,对瘤重抑制率影响较小,但仍有1只动物死亡;给予100U/kgCPG2后,瘤重抑制率37.6%,未出现动物死亡;给予50U/kgCPG2后,瘤重抑制率为45.5%,有1只动物死亡。给予不同剂量的CPG2后,裸鼠体重也出现一定的下降,但下降幅度较单用MTX组低,且恢复的速度也较快。每次实验结束时测量各组小鼠的血清肌酐和尿素氮,检测结果发现即使给予500-800mg/kg的MTX,小鼠未出现因使用HDMTX所引起的肾脏损伤,各组小鼠的血清肌酐和尿素氮并没有出现明显的变化,与未给予MTX的小鼠比较,没有出现统计学差别。肾脏病理切片也未发现明显的病理学变化。提示,给予HDMTX后,在小鼠体内出现HDMTX所致毒性机率较低。以上实验可以得出:在体外,MTX暴露2小时(含以上)可以对受试肿瘤细胞的生长有较强的抑制效应;CPG2能够消除MTX对体外癌细胞的生长抑制效应,但MTX暴露2小时后再合用,CPG2对MTX已经产生的抗癌效应基本没有影响。在体内,CPG2能很好的拮抗HDMTX在小鼠体内所致毒性,减少动物死亡数量,使动物体重更快恢复;CPG2给药时间应在MTX给药后12-16h,可以尽量避免HDMTX所致的毒性或动物死亡;CPG2的给药剂量在50-100U/kg时,对MTX抗肿瘤作用基本没有影响。