随着现代分子生物学理论和技术的深入和发展，人们认识到从细胞基因水平的异常能够更为深入细致地解释细胞癌变的过程。在高等真核多细胞生命体中，存在着一个极为复杂而精确的分子调节网络，维持细胞的正常性状以及细胞群的稳定。在所有的恶性肿瘤中都存在着癌基因的激活，扩增和/或抑癌基因的失活，缺失。同时也普遍存在着细胞周期和凋亡的调节失控，导致癌变细胞凋亡减少，长时间处于增殖状态。 我国食管癌发病率高于世界水平，是一种预后较差的常见恶性肿瘤。本研究的目的在于通过对细胞周期调节基因p16转染食管癌细胞的研究，了解p16在食管癌基因治疗方面的可能价值。p16ink4的表达产物在细胞G₁期可特异性地与CyclinD₁/CDK4复合物结合，阻止其对pRb蛋白的去磷酸化作用，从而阻止G₁期至S期的转化。在多种肿瘤细胞中均观察到这一现象，因此p16也称为多肿瘤抑制基因（MTS1）。有研究报道在食管中p16有较高的缺失率。p16蛋白的表达状态也与食管癌的临床病理分期和淋巴结转移率有关，而且在食管鳞癌中更为普遍一些。因此通过导入外源性野生型p16基因，上调p16蛋白表达水平将可能观察到食管癌细胞生长受抑制的现象，为食管癌更有效的基因治疗打下基础。 本实验利用分子克隆技术将p16cDNA编码区片段成功地克隆到PcDNA3表达质粒上，构建PcDNA3-p16真核表达系统。利用脂质体转染技术术将PcDNA3-P16和PcDNA3-neo导入了食管鳞癌细胞系 弟四军医大学博士学位论文 pC109中，证实了有p16蛋白表达，而对照组无p16蛋白表达，并检 恻了其瞬时表达和稳定表达时的细胞生长状况． 免疫组化（Supe。i幻on）和兔疫荧光染色提示外源性p16基因导 入 E C109细胞后有 P16蛋白表达和大量 wA拷贝，证实 T P16已成 功导入 Ea09细胞并表达相应蛋白产物．而对照组均为阴性． 对转染后生长状况的观察：我们发现在P16转染后72小时左右，一 细胞生长明显减慢，细胞内可见透明颗粒、细胞间隙变大、细胞肿胀、 脱落悬浮，此时提取细胞进行了流式细胞检测，发现有亚Gl峰出现； 透射电镜观察可见细胞线粒体肿胀，染色质核膜下聚集，有凋亡小体 形成；DNA片段化电泳发现梯状电泳带，以上现象均提示有细胞凋亡 存在． 穗定表达时通过MTT染色法测定生长抑制率发现pl6转染组有 35．l％抑制率，流式细胞仪显示转染P16后细胞Gl明显升高，有Gl期 阻滞发生（P＜0刀工），细胞克隆形成率和生长曲线与对瓜组相比，均 有显著差异（P＜0．01），证实了外源性…6基因的生长抑制作用． 以上实验结果我们认为外源性盯 基固对食管癌细胞有明显的生 长抑制作用，瞬时表达还可以诱导细胞凋亡．其中的机理可能是：① p16蛋白可抑制Cyclin－D；／CDK4活性，阻止pAn活化从而造成Gl期阻 滞①细胞凋亡调节是由多囚子调节完成，但主要发生在周期阻滞的个 细胞，因而外源性P16使细胞周期停滞，则细胞易于发生凋亡。 总之，P16基因在食管癌基因治疗方面有其潜在的应用价值．