研究背景和目的胃癌是常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。胃癌的治疗是世界性的难题，近年来随着以外科手术为主的综合治疗的应用，其预后有所改善，但5年生存率仍不满意。为了满足胃癌这种复杂疾病的治疗要求，有必要寻找新型有效的抗肿瘤药物。肿瘤细胞主要依赖糖酵解产生ATP获得能量，抑制糖酵解可诱导细胞凋亡，以抗肿瘤能量代谢为治疗靶点的药物称为抗能量药物，柠檬酸钠（SCT）是其中的代表。磷酸果糖激酶1（PFK-1）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）是催化糖酵解途径的关键酶，其中PFK-1的调控作用最强，若能抑制PFK-1活性，则能抑制糖酵解。研究资料显示，SCT作为PFK-1的抑制剂，能通过与PFK-1的抑制性结合位点结合从而抑制该酶的活性。此外还有研究证实，当肿瘤细胞的糖酵解被抑制、ATP枯竭时可产生持续性的DNA降解，导致肿瘤细胞线粒体通透性增强，通过释放细胞色素C（Cyt-C）、激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）而诱导细胞凋亡。细胞凋亡的启动和进行受到精确调控，具有独特的信号系统。线粒体是细胞能量的代谢中心，线粒体通路作为凋亡信号传导的重要通路，受多种凋亡基因或蛋白调控，如Bcl-2家族等。Cyt-C的释放是线粒体凋亡通路激活的标志。通过对这些凋亡基因或蛋白的研究，能为阐明药物的作用机制提供依据。本课题前期研究已经证明SCT在体外可抑制胃癌细胞增殖，但其作用机制及其与糖酵解有无联系尚不清楚；此外，SCT在体内对人胃癌裸鼠移植瘤的生长有无抑制作用及其机制未见报道。通过前期实验，我们推测SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起凋亡基因或蛋白表达改变，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加,活化caspase来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌生长的作用。为了证实这一推测，本实验通过应用人胃癌细胞株SGC-7901和人胃癌裸鼠移植瘤模型，研究SCT在体外和体内对胃癌细胞增殖的影响，并探讨其作用机制，以期为胃癌的药物治疗提供新的实验依据和研究思路。研究内容第一章柠檬酸钠对胃癌细胞增殖的影响及其作用机制实验方法培养人胃癌细胞株SGC-7901，随机分为5组：SCT低、中、高浓度组（5mmol/L﹑10mmol/L﹑20mmol/L），阳性对照5-FU组（0.5mmol/L）及空白对照组，分别对其用药，观察药物对胃癌细胞增殖的影响。采用倒置显微镜观察细胞生长情况，流式细胞仪技术检测细胞凋亡和周期的改变，6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法检测细胞PFK-1、HK、PK活性，分光光度法检测糖酵解终产物乳酸的含量，RT-PCR检测凋亡相关基因mRNA的表达。实验结果1、显微镜观察结果：用药24h、48h后，低、中、高浓度SCT及5-FU对胃癌细胞的增殖均有显著抑制作用，SCT的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性。SCT高浓度组的活细胞数目在24h与5-FU组比较，差异无统计学意义(P＞0.05),但在48h，SCT高浓度组的活细胞数目大于5-FU组(P＜0.05)。在24h，SCT高浓度组的细胞增`殖抑制率与5-FU组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但在48h，SCT高浓度组的细胞增殖抑制率小于5-FU组(P＜0.05)。SCT各浓度组及5-FU组的胃癌细胞均出现凋亡形态学改变。2、流式细胞仪检测结果：用药24h、48h后，SCT各浓度组及5-FU组分别与空白对照组比较，细胞凋亡率显著增高(P＜0.05)，SCT各浓度组的细胞凋亡率随SCT浓度增加或用药时间延长而增高。在24h，SCT高浓度组的细胞凋亡率与5-FU组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但在48h,5-FU组的细胞凋亡率高于SCT高浓度组(P＜0.05)。SCT各浓度组及5-FU组细胞的G2/M期上升明显，且均能见到亚二倍体凋亡峰，而空白对照组细胞的G2/M期上升不明显，未检测出亚二倍体凋亡峰。3、PFK-1、HK、PK活性及乳酸含量检测结果：用药24h、48h后，SCT各浓度组细胞的PFK-1活性与乳酸含量显著低于5-FU组和空白对照组（P＜0.05），SCT各浓度组细胞的PFK-1活性与乳酸含量随SCT浓度增加或用药时间延长而降低。5-FU组的PFK-1、HK、PFK活性及乳酸含量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。SCT各浓度组细胞的HK、PK活性在24h、48h分别与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4、RT-PCR检测结果：用药24h后，SCT各浓度组Bax、Cyt-C mRNA的表达显著高于空白对照组，Bcl-2、Bcl-xL mRNA的表达显著低于空白对照组（P＜0.05）；SCT各浓度组Bax、Cyt-C mRNA的表达随SCT浓度增加而上调，Bcl-2、Bcl-xL mRNA的表达随SCT浓度增加而下调。5-FU组Bax mRNA的表达低于SCT高浓度组，但高于中浓度组（P＜0.05）；5-FU组Cyt-C、Bcl-2、Bcl-xL mRNA的表达与SCT中浓度组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验结论SCT对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖有较强的抑制作用。SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起促凋亡基因Bax表达增强、抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表达降低，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加，来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞增殖的作用。实验结果提示SCT可能是一种有效的抗肿瘤药物，值得进行体内研究。第二章柠檬酸钠对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及其作用机制实验方法采用人胃癌细胞株SGC-7901构建人胃癌裸鼠移植瘤模型，随机分为5组：SCT低、中、高剂量组（7.5mg/kg﹑15mg/kg﹑30mg/kg），阳性对照5-FU组（0.35mg/kg）、阴性对照生理盐水组（NS），每组12只，分别用药连续注射两周，NS组仅注射NS，观察SCT对移植瘤生长的影响。采用电镜进行细胞超微结构观察，TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡，6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法检测移植瘤PFK-1、HK、PK活性，分光光度法检测糖酵解终产物乳酸的含量，应用免疫组织化学法和蛋白印记法检测凋亡相关蛋白表达，利用生化分析仪检测裸鼠肝肾功能及血液学指标，镜下观察裸鼠肝肾组织切片。实验结果1、移植瘤生长的抑制：SCT各剂量组及5-FU组裸鼠的肿瘤重量、体积、抑瘤率分别与NS组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中，SCT高剂量组裸鼠的肿瘤重量、体积、抑瘤率分别与5-FU组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。2、透射电镜检测结果：SCT各剂量组及5-FU组裸鼠的移植瘤细胞在镜下可见典型的凋亡形态学改变：如细胞形状缩皱，核形缩小，染色质浓缩边集，内质网碎裂，胞质内有大小不等的空泡，部分线粒体增生水肿、出现空泡样变性，嵴分辨不清，可见典型的凋亡小体。而NS组裸鼠的移植瘤细胞大小均一，细胞核较大且核仁明显，未见染色质浓缩边集和凋亡小体。3、TUNEL法检测凋亡结果：SCT各剂量组裸鼠移植瘤细胞的平均凋亡指数分别为：SCT低剂量组37.52±5.19%、SCT中剂量组48.35±4.83%、SCT高剂量组57.23±6.57%、5-FU组49.18±7.64%、NS组4.32±0.69%；SCT各剂量组及5-FU组细胞的平均凋亡指数分别与NS组比较，差异有统计学意义；SCT组间的两两比较，差异有统计学意义，SCT各剂量组细胞的平均凋亡指数随SCT剂量增加而上升；5-FU组细胞的平均凋亡指数低于SCT高剂量组（P＜0.05），但其与SCT中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4、移植瘤PFK-1、HK、PK活性及乳酸含量检测结果：SCT各剂量组的PFK-1活性及乳酸含量显著低于5-FU组和NS组（P＜0.05），SCT各剂量组的PFK-1活性及乳酸含量随SCT剂量增加而降低，存在量效关系。5-FU组的PFK-1、HK、PK活性及乳酸含量和NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。SCT各剂量组的HK、PK活性与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）5、免疫组化结果：SCT各剂量组及5-FU组cleaved caspase-3、cleavedcaspase-9蛋白表达均高于NS组（P＜0.05），其中，5-FU组cleaved caspase-3蛋白表达低于SCT高剂量组但高于SCT中剂量组，5-FU组cleaved caspase-9蛋白表达高于SCT高剂量组（P＜0.05），SCT各剂量组cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达随SCT剂量增加而上调（P＜0.05）。6、蛋白印记法检测结果：SCT各剂量组Bax、Cyt-C蛋白表达显著高于NS组，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达显著低于NS组（P＜0.05）；SCT各剂量组Bax、Cyt-C蛋白表达随SCT剂量增加而上调，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达随SCT剂量增加而下调（P＜0.05）。5-FU组Bax、Bcl-xL蛋白表达与SCT高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），5-FU组Bax蛋白表达高于SCT中剂量组，5-FU组Bcl-xL蛋白表达低于SCT中剂量组（P＜0.05）。5-FU组Cyt-C、Bcl-2蛋白表达与SCT中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），5-FU组Cyt-C蛋白表达低于SCT高剂量组，5-FU组Bcl-2蛋白表达高于SCT高剂量组（P＜0.05）。7、裸鼠肝肾功能和血液学检测结果：SCT各剂量组裸鼠的谷丙转氨酶、白蛋白、总胆红素、尿素氮、肌酐与NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；5-FU组与NS组比较，其谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐均不同程度升高，白蛋白降低（P＜0.05），但总胆红素无显著差异（P＞0.05）。SCT各剂量组裸鼠的白细胞、血小板、血红蛋白与NS组比较，差异无统计学意义，5-FU组裸鼠的白细胞、血小板与NS组比较，均显著降低（P＜0.05），但血红蛋白无显著差异（P＞0.05）。裸鼠肝肾组织切片显示，5-FU组裸鼠的肝肾切片可见坏死组织，而SCT各剂量组及NS组裸鼠的肝肾切片未见明显异常。实验结论SCT对人胃癌裸鼠移植瘤的生长有较强的抑制作用。SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起促凋亡蛋白Bax表达增强、抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达降低，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加,活化caspase-3和caspase-9来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌生长的作用。SCT在裸鼠体内显示出较高的药物安全性。全文研究结论本研究首次报道抗能量药物SCT在体外对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖及体内对人胃癌裸鼠移植瘤的生长均有较强的抑制作用，在实验剂量范围内，SCT与传统化疗药5-FU的疗效相似。SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起促凋亡蛋白Bax表达增强、抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达降低，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加,活化caspase-3和caspase-9来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌生长的作用。SCT在裸鼠体内显示出较高的药物安全性，其有可能成为一种新型有效的抗肿瘤药物。本研究为胃癌的药物治疗提供了新的实验依据和研究思路。