颅脑爆震伤是现在战争中最常见的病种之一,其死亡率高达30-40%,因其致伤的多重性、复杂性及严重性成为颅脑火器伤的研究重点,并成为当今创伤医学领域研究的焦点之一,因此研究颅脑爆震伤的创伤机制及治疗策略具有重要的临床意义和现实意义。颅脑爆震伤的基础研究首先依赖于可靠的动物模型,国外的研究者Long,Nakagawa,国内的楚燕飞、侯立军在这方面做了很多的工作,然而建立的爆震伤相关动物模型仍具有颅脑爆震伤效果不稳定,模型动物存活时间过短等缺点,因此如何解决既往研究模型存在的问题,建立一个可靠稳定的动物模型,是爆震伤机制研究急需解决的一个问题。大黄素是我国传统中药大黄的有效成分之一。既往研究发现,大黄素具有拮抗氧自由基、延缓衰老、抑制炎症反应、提高免疫力等多种作用。近年来,大黄素的具有的神经系统保护作用越来越受到关注,有研究表明:大黄及其提取物可以有效改善大鼠脑缺血损伤后的神经症状、显著降低损伤的脑组织含水量、减轻脑缺血再灌注后造成的脑组织损伤。此外,大黄素还可以有效的减轻脑损伤后的炎症反应,促进神经功能的恢复。然而,大黄素通过抑制炎症作用实现脑损伤后神经保护的机制尚未明确,有待进一步研究。因此本研究首先探索并成功建立稳定的大鼠颅脑爆震伤模型,再通过大黄素干预,明确了大黄素对颅脑爆震伤造成的脑组织损伤的保护作用。最后我们以TLR4为作用靶点,通过细胞实验探讨了大黄素保护颅脑爆震伤的机制,为临床治疗颅脑爆震伤奠定理论基础。1.新型大鼠颅脑爆震伤模型的建立使用l ml 1.5%的戊巴比妥钠腹腔注射充分麻醉大鼠,麻醉后,将大鼠的四肢以及头部固定于铝制箱体的动物保护舱内,使大鼠背部紧靠在保护舱侧壁,调节保护舱侧壁上的圆形爆炸窗口以及大鼠的位置,最终使得大鼠的额顶枕部全部置于爆炸窗内,充分保护大鼠除头颅之外的所有部位。将400mgTNT当量纸质电雷管放置在爆炸窗圆心侧方水平处,分别在距离7.5 cm、10 cm以及15 cm的位置处将雷管引爆。观察各爆炸距离组大鼠在受伤后的相关生理行为,测量大鼠脑组织含水量以及进行病理学检查,确定大鼠颅脑爆震伤动物模型成功与否。实验结果显示各实验组大鼠均出现显著的呼吸节律的变化,主要表现在出现短暂的呼吸暂停,呼吸变深变慢。在7.5cm爆炸组的大鼠在爆炸三天后该实验组所有的大鼠全部死亡。其余实验组未出现死亡。脑含水量结果显示,爆炸组大鼠的脑含水量明显高于正常大鼠。病理切片实验结果显示,爆炸距离为10cm实验组大鼠的脑组织中出现明显损伤以及脑水肿。而爆炸距离为15cm实验组的大鼠脑组织中没有明显的损伤。上述结果提示,10cm为建立大鼠颅脑爆震伤动物模型的最佳爆炸距离,动物模型建立成功。2.大黄素对大鼠颅脑爆震伤脑组织具有显著的保护作用2.1大黄素能够显著降低颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的il-1β含量为了检测大鼠颅脑爆震伤之后脑组织中促炎因子的变化情况,我们使用elisa实验检测颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中促炎因子il-1β的含量。实验结果显示颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的il-1β含量显著高于正常的大鼠脑组织中的il-1β含量。为了检测大黄素对爆震伤模型大鼠脑组织中促炎因子il-1β的含量的影响,我们使用大黄素作用颅脑爆震伤模型大鼠,分别检测颅脑爆震伤后第1d,2d,3d,5d,7d后大鼠脑组织中促炎因子il-1β的含量。实验结果显示大黄素在实验的上述各个时间点均能够显著抑制颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中il-1β含量,并最终可使il-1β含量基本降低至正常大鼠的水平。上述实验结果提示,大鼠受到颅脑爆震伤之后,脑组织中炎症细胞因子il-1β含量显著升高,但是大黄素能显著的抑制il-1β分泌。提示大黄素能够抑制由颅脑爆震伤引起的炎症反应。2.2大黄素能够显著降低颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的tnf-a含量。为了检测大鼠颅脑爆震伤之后脑组织中促炎因子的变化情况,我们使用elisa实验检测颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中促炎因子tnf-a的含量。elisa实验结果表明颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的tnf-a含量显著高于正常的大鼠脑组织中的tnf-a含量,第5天时tnf-a含量略有下降,但仍显著高于对照组。为了检测大黄素对爆震伤模型大鼠脑组织中促炎因子tnf-a的含量的影响,我们使用大黄素作用颅脑爆震伤模型大鼠,分别检测颅脑爆震伤后1d,2d,3d,5d和第7天后大鼠脑组织中促炎因子tnf-a的含量。实验结果显示大黄素在不同时间点均能够抑制颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中tnf-a含量,使tnf-a含量基本降低至正常大鼠的水平。上述实验结果提示,大鼠受到颅脑爆震伤之后,脑组织中炎症细胞因子tnf-a含量显著升高,但是大黄素能显著的抑制tnf-a的分泌。提示大黄素能够抑制由颅脑爆震伤引起的炎症反应。2.3大黄素显著降低颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的含水量为了探讨大黄素对颅脑爆震伤后大鼠脑组织中含水量的影响,即大黄素对缓解颅脑爆震伤后形成的脑组织水肿之间的关系。我们采用干湿法检测了各个实验组颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的含水量。实验结果显示,与对照组正常大鼠脑组织中的含水量相比,颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的含水显著增高,含水量随时间的推移逐渐减少,但仍然显著高于正常的大鼠水平。大黄素能够显著的降低颅脑爆震伤模型大鼠脑组织中的含水量。上述实验结果提示大黄素能够显著减轻颅脑爆震伤引起的脑水肿现象。2.4大黄素显著减轻颅脑爆震伤模型大鼠的脑组织损伤为了进一步观察大黄素对颅脑爆震伤模型大鼠的脑组织的保护情况,我们使用he染色和电镜观察大黄素处理前后大鼠颅脑爆震伤模型的脑组织损伤的情况变化。结果显示,大鼠颅脑爆震伤模型的脑组织中出现明显的损伤现象:毛细血管损伤,细胞间隙以及血管间隙的扩大,神经纤维破损,大量的神经元丢失现象,弥散性蛛网膜下腔出血以及水肿现象。电镜下可见神经细胞细胞核染色质有轻度聚集,细胞浆内,线粒体肿胀明显,核糖体丢失。然而大黄素处理组的大鼠脑组织中各种病理性的变化较未经大黄素处理组相比程度减轻。上述实验结果提示,大黄素能够有效的减轻颅脑爆震伤对大鼠脑组织的损伤作用。3.大黄素对颅脑爆震伤的保护机制研究3.1大黄素可显著抑制ogd小胶质细胞分泌il-1β和tnf-a为了检测大黄素对ogd小胶质细胞中促炎因子il-1β和tnf-a含量的影响,我们使用不同浓度的大黄素刺激ogd模型小胶质细胞,elisa实验检测ogd模型小胶质细胞培养上清中细胞因子il-1β和tnf-a分泌。实验结果显示,与对照组相比,ogd模型小胶质细胞上清中il-1β和tnf-a的浓度显著高于正常的小胶质细胞对照组。大黄素能够抑制ogd模型小胶质细胞分泌il-1β和tnf-a,并呈现浓度依赖性。当大黄素的终浓度为40μmol/l时,作用效果最明显。提示40μmol/l大黄素可有效的抑制ogd模型小胶质细胞诱导的炎症因子il-1β和tnf-a分泌,因此在后续的相关试验中我们选择40μmol/l作为大黄素的最佳作用浓度。3.2大黄素显著下调ogd模型小胶质细胞中tlr4的蛋白和mrna表达量为了进一步确定大黄素对ogd模型小胶质细胞中tlr4相关信号通路的活化的影响,我们采用westernblot和qrt-pcr两种实验方法分别检测了大黄素刺激前后ogd模型小胶质细胞中tlr4的蛋白和mrna表达水平。实验结果显示,与正常小胶质细胞相比,ogd模型小胶质细胞中tlr4的蛋白和mrna表达量显著上调。但是经过40μmol/l大黄素刺激后ogd模型小胶质细胞中tlr4的蛋白和mrna表达水平显著下调。上述实验结果提示大黄素能够显著抑制ogd模型小胶质细胞中tlr4的表达。3.3大黄素抑制ogd模型小胶质细胞中tlr4介导的myd88依赖途径的活化为了进一步确定大黄素对ogd模型小胶质细胞中tlr4介导的相关信号通路的活化的影响,我们采用westernblot实验方法检测大黄素刺激ogd模型小胶质细胞后tlr4信号通路相关信号分子myd88的蛋白表达水平以及iκb的磷酸化水平。实验结果显示,与正常的小胶质细胞相比,ogd模型小胶质细胞中myd88的蛋白表达水平以及iκb的磷酸化水平显著上调。但是经过40μmol/l大黄素刺激后,显著抑制ogd模型小胶质细胞的myd88的蛋白表达水平以及iκb的磷酸化水平。提示大黄素能够抑制tlr4介导的myd88依赖途径信号通路的活化。3.4大黄素通过抑制ogd模型小胶质细胞中tlr4介导的myd88依赖途径的活化降低il-1β和tnf-a炎症因子的分泌为了进一步确定大黄素是否是通过抑制ogd模型小胶质细胞中tlr4介导的myd88依赖途径的活化而发挥抑制炎症因子的释放,我们首先使用tlr4抗体预处理ogd模型小胶质细胞。采用elisa实验检测小胶质细胞培养上清中il-1β和tnf-a的含量。实验结果显示,与对照组相比,ogd模型小胶质细胞中il-1β和tnf-a含量显著上升,大黄素可显著抑制ogd模型小胶质细胞分泌il-1β和tnf-a。此外,使用tlr4抗体预处理ogd模型小胶质细胞后,大黄素对ogd模型小胶质细胞分泌il-1β和tnf-a不会产生明显影响。接下来我们使用同样的方式对小胶质细胞进行处理,并采用westernblot实验检测tlr4下游相关信号分子myd88表达以及iκb的磷酸化水平。实验结果显示,ogd模型小胶质细胞中myd88表达以及iκb的磷酸化显著上调,大黄素可有效下调myd88表达以及iκb的磷酸化。使用大黄素刺激tlr4抗体预处理ogd模型小胶质细胞后,ogd模型小胶质细胞中myd88表达以及iκb的磷酸化水平没有明显变化。综上所述,本研究首次建立并使用了本课题组前期的稳定的大鼠颅脑爆震伤动物模型,为后续实验的开展创造了良好的必备的实验条件。接下来,我们检测了大黄素对颅脑爆震伤造成的大鼠脑组织损害的影响,进一步证实大黄素通过抑制相关促炎因子的释放,降低爆震伤引起的继发性脑损伤起到保护神经功能的作用。最后,本研究详细探讨了大黄素减轻颅脑爆震伤继发性损伤的作用机制,证实大黄素通过抑制tlr4介导的MyD88信号通路活化,进一步抑制小胶质细胞炎症因子的分泌,从而减轻爆震伤后炎症反应引起的相关并发症,起到保护神经功能的作用。本研究首次发现了大黄素通过抑制TLR4介导的MyD88信号通路的活化发挥保护颅脑爆震伤的作用机制。为临床上治疗颅脑爆震伤奠定了理论基础。