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猪圆环病毒2型(Porcine circuvirus 2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。PCV2包含两个开放式阅读框ORF1和ORF2，其分别编码病毒复制酶相关蛋白(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)，其中Cap蛋白含有病毒主要抗原表位，可诱导猪体产生免疫保护作用。干扰素是一类抗病毒蛋白，它可阻止另一种病毒增殖。其中IFN-α具有广谱的抗病毒作用，表现在抑制病毒复制、减缓病毒传播速度以及降低感染细胞损伤程度。1．PCV2 Cap蛋白于大肠杆菌系统中的表达、纯化与抗原性分析本研究通过PCR方法获得PCV2的ORF2全长基因，通过EcoRI／NotI酶切选取3’羧基端片段，插入原核表达载体pGEX-6p-1EcoRI／NotI酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，涂布胺苄平板，挑选单个菌落，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析，获得Cap蛋白羧基端片段重组质粒。再将阳性质粒转化大肠杆菌BL21，对诱导表达条件进行优化，结果为加入终浓度为0.3mM IPTG、30℃诱导表达6小时，可以有效表达重组蛋白，大小约为40kD，具有PCV2抗原性．收集菌体并进行超声裂解后证实，表达产物以可溶蛋白与包涵体两种形式存在。分别利用GST亲和柱以及包含体洗涤尿素变性方法分别提取纯化可溶蛋白与包涵体，用已知PCV2阳性血清进行ELISA试验鉴定重组蛋白具有PCV2抗原性，结果表明两种方法提纯的重组Cap蛋白的抗原性无明显差异。2．PCV2 Cap-IFNα融合蛋白重组腺病毒的构建与鉴定用已构建的PCV2 ORF2和PRRSV ORF5重组质粒rShuttle-ORF2-ORF5中经KpnⅠ酶切获得ORF2段基因，同时将已经含有猪IFNα基因的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-IFNα用KpnⅠ线性化，将目的基因克隆至上述重组质粒中，转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那平板，挑选单个菌落，提取质粒进行PCR及KonⅠ酶切鉴定，成功构建质粒pShuttle-CMV-ORF2-IFNα，然后将该重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，进行同源重组，经PCR及PacⅠ酶切鉴定，挑选阳性重组质粒pAd-ORF2-IFNα，转染HEK-293A细胞，获得重组腺病毒rAd-Cap-IFNα。经RT-PCR及Western blot证明融合蛋白得到正确表达，大小约为49kD。将4周龄的BALB／c健康小鼠分为4个组，每组5只，其中1，2，3组分别免疫rAd-IFNα、rAd-Cap和rAd-Cap-IFNα，第四组为空白对照组．免疫后不同时间采取小鼠血清，用重组Cap蛋白进行EuSA检测PCV2抗体，结果显示小鼠在首免2周后，除了rAd-Cap-IFNα免疫组可以检测到特异性PCV2抗体外，其余各组均检测不到抗体。加强免疫后2周，rAd-Cap-IFNα免疫组效价上升至1∶800，而rAd-Cap免疫组效价只达到1∶50，表明这种融合蛋白比腺病毒表达的单独cap更早诱导产生ELISA抗体，且在一定程度上增强了小鼠对PCV2的Cap蛋白的体液免疫反应。综上所述，本研究将PCV2的ORF2部分以及全长基因克隆入不同的表达载体，并均可获得有效表达，并有较好的免疫原性．由大肠杆菌表达的Cap具有表达量高、包涵体易纯化等特点，可作为诊断抗原．腺病毒载体表达的Cap-IFNα，可以增强Cap蛋白在小鼠的体液免疫反应，为PCV2的基因工程疫苗的研究奠定了基础．