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团头鲂(Megalobrama amblycephala)属于鲤科鲤亚科鲂属,草食性,是仅存于我国的一种重要淡水养殖鱼类,具有非常好的市场需求。然而,近年来随着养殖密度的扩大和环境污染等因素的影响,各类疾病频繁爆发。尤其以嗜水气单胞菌的侵扰最为猛烈,引起团头鲂大量死亡,使团头鲂的养殖业发展遭受了巨大的损失。白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),是迄今为止发现的具有广泛生物学效应的细胞因子之一,在先天性免疫与获得性免疫方面皆具有重要作用,已有研究表明其在抵抗病原微生物入侵方面起着重要作用。为了阐明IL-6基因在团头鲂抵抗嗜水气单胞菌感染过程中的可能作用,本研究分析了团头鲂IL-6基因(Mam IL-6)的序列特征,组织分布情况以及细菌感染后在免疫相关组织中的表达情况。此外,构建了一系列Mam IL-6启动子p GL3重组载体并转染进细胞,并用LPS诱导转染过重组载体的细胞,分析LPS对Mam IL-6启动子活性的影响,为进一步对IL-6转录调控机理的研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.Mam IL-6的序列及表达分析Mam IL-6基因的c DNA序列全长为1092 bp,其中ORF为699 bp,编码233个氨基酸,5’非编码区80 bp,3’UTR 313 bp,3’UTR有9个不稳定的基序。Signal P等软件预测显示,Mam IL-6基因有一段由24个氨基酸组成的信号肽。多氨基酸序列比对与系统进化分析表明,脊椎动物IL-6氨基酸序列的同源性很低,然而其蛋白结构与基因结构却很保守,Mam IL-6蛋白有一个典型的家族信号(C-X(9)-C-X(6)-G-L-X(2)-Y-X(3)-L)和4个保守的α螺旋,其基因结构包含5个外显子与4个内含子。在健康团头鲂成鱼11个组织中,Mam IL-6在脾脏中的表达量最高;嗜水气单胞菌感染后,Mam IL-6的表达量在被检测的免疫相关组织中均显著增加,这表明团头鲂在进行免疫反应时,IL-6基因起举足轻重的作用。2.Mam IL-6候选启动子的生物信息学分析对团头鲂候选启动子区域(-1503 bp至+34 bp)进行生物信息学分析,发现位于TSS上游21 bp处有一个TATA BOX,此外,还发现了许多重要的转录因子结合位点,包括GRE,USF,CETS1,AP-1,GATA,CRE,STAT,C/EBPβ,NFAT,IRF,SP1,AP-2,NF-κB等。通过对不同物种IL-6基因近端启动子序列进行分析,发现一些重要的转录因子比较保守,如GRE,NF-κB,AP-1,GATA等。3.Mam IL-6启动子系列缺失体的构建及活性分析成功构建了5个不同长度的重组载体(PGL3-IL-6P),以PGL3-basic质粒作为阴性对照,将它们分别与内参质粒共转染进鲤EPC细胞中,24 h后测定荧光素酶的活性。双荧光素酶检测结果显示:与阴性对照PGL3-basic质粒转染组相比,PGL3-IL-6P-0,PGL3-IL-6P-1,PGL3-IL-6P-2,PGL3-IL-6P-3以及PGL3-IL-6P-4质粒转染组的荧光素酶活性均明显升高,其中PGL3-IL-6P-4质粒转染组的荧光素酶活性最高,说明启动子缺失体PGL3-IL-6P-4(-379至+34)包含核心启动子区。用100ng/m L的LPS刺激转染过重组载体的细胞发现,与未经LPS刺激组相比,仅PGL3-IL-6P-4的活性显著增加,而其余缺失体的活性则无明显变化,这进一步说明了PGL3-IL-6P-4缺失体确实包含核心启动子区,并推测该区域存在的潜在转录因子NF-кB和C/EBPβ等可能是响应LPS刺激的重要作用元件。