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脯氨酸氧化成谷氨酸过程中需要两种酶的催化:脯氨酸脱氢酶(PDH)和5-二氢吡咯羧酸脱氢酶(P5CDH)。在根瘤菌中,.这两种酶是由putA基因编码的。本工作通过分子生物学的方法克隆到了快生型费氏中华根瘤菌HN01中的putA基因。生物信息学分析表明,该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌Rm1021的putA基因相比,在核苷酸水平上有85%的同源性,在氨基酸水平上有87%的同源性。
通过融合PCR的方法在putA基因潜在的启动子区域下游导入无启动子的gus报告基因,再将这个融合片段插入载体pLAFR6构建表达质粒,然后导入费氏中华根瘤菌HN01中,并对这个重组根瘤菌进行GUS活性检测,结果表明,该基因启动子的表达受脯氨酸诱导,当脯氨酸的浓度达到500μM时,启动子活性最高。
通过自杀质粒pK18mob同源单交换的方法构建了putA基因的非极性突变体GXHNPA和极性突变体GXHNPB。通过对突变体进行生长影响的测试,发现突变体在以脯氨酸为唯一碳、氮源的MM培养基中不能生长。植株试验表明,突变体比出发菌株HN01现瘤时间推迟1天,竞争结瘤能力下降,但在结瘤效率、固氮方面均无显著差异。