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酪蛋白激酶1(Casein Kinase1，Csnk1)属于丝/苏氨酸蛋白激酶，已经在哺乳动物中发现并得到了7个Csnk1的同工酶，分别是Csnk1a、Csnk1b、Csnk1g1、Csnk1 g2、Csnk1g3、Csnk1d和Csnk1ε。相关研究表明，Csnk1ε的碱基缺失或突变可能对毛囊发育和毛发生长具有一定影响。CRISPR/Cas系统是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。为深入研究Csnk1ε对毛囊的作用，本实验设计以CRISPR/Cas9系统介导使得Csnk1ε定点整合于小鼠Rosa26位点上，再通过原核显微注射技术技术，制备Csnk1ε转基因小鼠。通过PCR及Southern Blot检测方法鉴定阳性小鼠，并通过Real-time PCR，Western Blot方法对转基因阳性小鼠进行表达检测。 1、sgRNA载体及打靶载体构建 本实验通过麻省理工学院的CRISPR Design软件设计5对sgRNA，以sgRNA-T2为模板，扩增得到相应的U6启动子和sgRNA骨架载体，最终构建得到完整的sgRNA载体。打靶载体的构建是以人源K14启动子，即皮肤特异性启动子启动目的基因，经测序得知其同源性为98％。为了确保该启动子的启动功能，本实验构建了以该启动子启动的红色荧光蛋白表达载体pK14-DsRed，用以下一步细胞水平检测。再利用同源重组技术原理在已经确定的靶位点，即小鼠Rosa26第一内含子处，分别向上、下各取1kb左右作为打靶载体的上、下游同源臂，最终将打靶载体构建成功。 2、细胞水平的相关检测 本研究主要利用电穿孔转染法将红色荧光蛋白表达载体pCMV-DsRed导入MEF中，筛选出适应于MEF的最优转染条件，即160V/5Ms。利用该转染条件将Cas9载体和sgRNA载体共同转染于MEF中，培养48h后提取基因组，通过设计跨靶位点的PCR引物进行PCR扩增，扩增产物经杂交后再通过Surveyor突变检测试剂盒进行鉴定，从而确定sgRNA敲除位点为Rosa26基因的第一内含子的第1096bp处，其敲除效率为36.52％。同理，将构建好的人源K14启动子启动的红色荧光蛋白表达载体pK14-DsRed，导入MEF中，通过观察红荧光的表达情况可知该启动子具有启动功能，可用于下一步实验中。最后将hCas9载体、sgRNA载体及打靶载体共转染于MEF中，进行PCR检测，结果表明具备同源重组条件，可用于下一步转基因打靶小鼠的建立，同时该检测引物可用于转基因阳性小鼠的检测。 3、Csnk1ε转基因小鼠的制备及鉴定 本研究将构建好的Csnk1ε打靶载体，根据同源重组技术原理，利用原核显微注射法制备小鼠18只，通过PCR及Southern Blot鉴定后得到Csnk1ε随机整合阳性小鼠1只，并未得到Csnk1ε定点整合的阳性小鼠。随机整合阳性小鼠通过传代得到F1代阳性小鼠1只，说明该转基因阳性小鼠能够将外源基因稳定遗传给予代。本实验成功构建出Csnk1ε转基因小鼠模型，为以后研究该基因的功能创造了实验条件。 4、Csnk1ε转基因小鼠表达水平的检测 本实验首先对转基因阳性小鼠进行了mRNA水平的检测，以GAPDH为内参基因，通过Real-time PCR检测结果为:转基因阳性小鼠Csnk1εmRNA表达量是同窝对照小鼠的2.65倍。然后对其进行蛋白质水平的检测，以α-tubulin为内参基因，通过Western Blot检测结果是同窝对照小鼠的1.243倍。通过上述检测手段，说明目的基因已经成功转入小鼠的基因组并稳定表达。