背景糖尿病是一种严重威胁机体健康的慢性疾病。据国际糖尿病联合会估计,目前全球成人糖尿病患者总数超过4.63亿,2030年底将会有5.78亿,2045年底将达到7亿。随着患病人数不断增加,糖尿病已经成为世界范围内的一种流行性疾病。与此同时,糖尿病相关并发症的发生率也在不断增加,是目前临床医生面临的主要问题。糖尿病足感染（Diabetic Foot Infection,DFI）是最常见的糖尿病相关破坏性并发症,DFI患者的住院风险为不伴感染糖尿病足（Diabetic Foot,DF）患者的55.7倍,截肢风险为154.5倍。DFI抗感染治疗效果不佳将导致感染逐渐进展,最终侵及骨骼,即糖尿病足骨髓炎（Diabetic Foot Osteomyelitis,DFO）,是DF发展最严重的阶段。超过20%的中度DFI和50%-60%的重度DFI是DFO。大约59.4%的DFO患者会遭受截肢,截肢后患者的5年生存率也仅为50%。及时、有效地控制感染是降低DFO患者截肢率和死亡率的关键,而提高抗感染治疗效果的前提是提高创面微生物鉴定的时效性、全面性和准确性,是当今世界一项亟需突破的难题。目前临床上鉴别DFO创面微生物使用的是传统培养法,该方法历史悠久,操作流程成熟,且花费不高。本课题组既往也回顾性分析了基于培养法的DFO创面和浅表感染创面微生物组成的差异,发现DFO创面以革兰阴性（Gram-negative,G-）菌为主,而浅表感染创面以格兰阳性（Gram-positive,G+）菌占优势。在研究过程中发现,培养法具有耗时长（普通培养需要3-5天,药敏实验需要1-2周）和敏感度低等缺点,在鉴定某些对生长环境要求高和未知的微生物时存在一定困难,无法第一时间正确指导临床抗生素的选择和使用。而根据既往培养结果经验性选用抗生素治疗的效果也不尽如人意,据估计,56%的DFI患者由于经验性抗感染治疗效果不佳而后更改了治疗方案,浪费了宝贵的治疗时间,延误了最佳治疗时机,导致患者病情加重。目前急需探索对微生物鉴定更快、更全面、更敏感的新方法、新技术,以全面分析DFO创面微生物的组成。高通量测序技术不依赖培养,可以快速且全面地获得创面微生物组成及功能信息,为微生物研究领域提供了新的发展方向,使全面快速鉴定DFO创面微生物成为可能。目前在分析菌群组成方面使用最广泛的是16S rRNA测序,16S rRNA基因普遍存在于原核微生物中,是研究原核微生物多样性应用最广泛的分子标记。16S rRNA测序通过PCR放大16S rRNA基因的特定区域（根据实验需求选择V1-V9高变区中的1段或几段）,测序后与核糖体数据库计划（Ribosome Database Project,RDP）数据库比对,获得创面菌群组成及丰度信息。与传统培养法相比,该技术最大的优势在于无需培养,不受细菌生长环境限制,且测序速度快,对创面中菌群的认识更全面。Illumina是目前应用最广泛,运行速度最快的测序平台,本研究在严格执行标准取样流程的前提下基于Illumina测序平台对感染骨组织样品进行16S rRNA测序,分析创面菌群组成。16S rRNA测序选择性扩增目的基因片段获得的信息较少,即使经过不断优化也只能将细菌鉴定到属水平,无法获得种水平细菌的具体信息。而宏基因组测序技术的出现解决了这一难题,与16S rRNA测序相比,宏基因组测序是一种对样品中全部基因组进行测序分析的技术,能获取微生物更精细的分类学信息和更详细的基因序列信息,不仅能将细菌精确到菌种,甚至菌株水平,还能通过与功能数据库比对获取样品中微生物的功能信息。既往已经有研究使用宏基因组测序分析肠道、口腔、环境和慢性溃疡等生境中的微生物,证实了该测序技术的可行性,但尚未有研究使用该技术分析感染骨组织中微生物的结构,故本研究进一步探索宏基因组测序技术在感染骨组织样品微生物分析中的可行性,为该方法的临床一线使用提供证据,并将细菌精确鉴定到种水平,通过菌种与患者临床指标的相关性分析获取更详细的菌群信息,指导临床经验性抗感染治疗,同时分析创面中微生物的功能。不仅回答了创面中有哪些微生物,也回答了这些微生物能做什么的问题。既往对DFO创面微生物的研究都是以DFI浅表创面中的微生物作为对照,尚未有研究比较过同样深达骨的感染,有糖尿病和无糖尿病的患者创面微生物组成的差异,故本研究选取无糖尿病的创伤后足骨髓炎（Posttraumatic Foot Osteomyelitis,PFO）作为对照分析其与DFO创面微生物组成及功能的异同。第1章基于16S rRNA测序技术分析糖尿病足骨髓炎创面菌群组成目的验证16S rRNA高通量测序技术在感染骨组织菌群鉴定中的可行性,为临床经验性抗生素选择和快速鉴定创面菌群提供参考,为下一步宏基因组测序分析创面微生物提供对照。方法2018年9月至2019年4月期间前瞻性连续纳入17例确诊为DFO的患者（Dd组:Dd1、Dd2Ddl7）和11例确诊为无糖尿病的PFO患者（ND组:ND1、ND2ND11）,清创后采集创面深部感染骨组织样品,无菌条件下均分为两份,分别使用培养法和16S rRNA高通量测序技术分析创面菌群组成。结果1、测序共获得 1034689 条 Counts,7555 种 OTU采用Illumina测序平台,PE250测序方案对28例感染骨组织样品进行16S rRNA测序后获得1034689条Counts,聚类后获得7555种OTU;多样性指数稀疏曲线都趋于水平,证明当前测序深度足够,测序数据合理可信,再增加测序量也不会出现新的物种。2、Dd组菌群多样性大于ND组,组间菌群差异显著反映组内菌群多样性的指数:Shannon指数（t=1.996;P=0.058）和Simpson指数（t=2.913;P=0.009）在Dd组中高于ND组;反映组内菌群丰富度的指数:ACE 指数（t=-3.329;P=0.003）、Chao1 指数（t=-3.560;P=0.002）和 Observed OTUs（t=-3.423;P=0.002）在 Dd 组中低于 ND 组;基于 Weighted Unifrac 距离绘制的PCoA图显示组间菌群结构具有显著性差异（F=6.248;P=0.001）。3、16S rRNA测序较培养法获得更多细菌,以厌氧菌和G-菌为主培养Dd组感染骨组织样品获得的细菌隶属于变形菌门和厚壁菌门,分别为G-菌和G+菌;Dd组感染骨组织样品的16S rRNA测序获得21种菌门,5种优势菌门。培养Dd组感染骨组织样品获得10种菌属,分别是肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属和柠檬酸杆菌属,出现频率最高的是链球菌属（4/23;17.4%）和肠球菌属（4/23;17.4%）;16S rRNA测序共获得菌属242种,优势菌属18种,包含培养得到的所有细菌,出现频率最高的是普氏菌属。培养法获得的菌属中,G-菌占 52.2%（12/23）,G+菌占 47.8%（11/23）,无厌氧菌;16S rRNA测序获得的优势菌属中,G-菌占61.1%（11/18）,G+菌占38.9%（7/18）,需氧菌占22.2%（4/18）,兼性厌氧菌占27.8%（5/18）,严格厌氧菌占50.0%（9/18）。4、16S rRNA测序显示Dd组相对丰度最高的菌属是普氏菌属,ND组是盐单胞菌属在门水平,Dd组相对丰度最高的是厚壁菌门,其次是拟杆菌门,ND组是变形菌门;在科水平,Dd组相对丰度最高的是普雷沃氏菌科,ND组相对丰度最高的是盐单胞菌科;在属水平,Dd组相对丰度最高的是普氏菌属,ND组相对丰度最高的是盐单胞菌属;Dd组中普氏菌属的相对丰度显著高于ND组中该菌属的相对丰度（t=-3.817;P=0.002）,而ND组中盐单胞菌属的相对丰度显著高于Dd组中该菌属的相对丰度（t=-5.074;P<0.001）。5、梭菌属和普氏菌属是Dd组的标记菌群LEfSe差异分析显示,厚壁菌门（LDASCORE=5.25;P=0.001）,隶属于厚壁菌门的梭菌纲（LDA SCORE=5.03;P=0.029）以及隶属于梭菌纲的梭菌属（LDA SCORE=5.03;P=0.029）是Dd组中前三位最具代表性的核心菌群;其次还包括普雷沃氏菌科（LDASCORE=5.02;P=0.022）和隶属于普雷沃氏菌科的普氏菌属（LDASCORE=5.02;P=0.022）;螺菌目（LDASCORE=5.46;P<0.001）,隶属于螺菌目的盐单胞菌科（LDA SCORE=5.46;P<0.001）,隶属于盐单胞菌科的盐单胞菌属（LDA SCORE=5.46;P<0.001）以及包含螺菌目的变形菌门（LDASCORE=5.46;P=0.009）是ND组中最具代表性的核心菌群。结论1.16S rRNA高通量测序技术可以作为感染骨组织样品中菌群鉴定的快速有效方法;2.16S rRNA高通量测序技术在展示菌群多样性方面有很大优势,能发现很多不能培养的细菌,DFO中以G-菌和厌氧菌为主;3.DFO中相对丰度最高、分布最广和最具标记性的细菌均为普氏菌属（G-厌氧菌）,PFO中均为盐单胞菌属（G-需氧菌）,有必要根据两种骨髓炎创面菌群特征分别制定抗感染治疗方案。第2章 基于宏基因组测序技术分析糖尿病足骨髓炎创面微生物组成及功能目的建立一种利用宏基因组测序技术分析感染骨组织中微生物的方法,为全面、快速鉴定创面微生物提供参考;分析DFO创面微生物组成并探索与其可能相关的临床指标,指导临床经验性抗感染治疗;阐述微生物功能,帮助全面认识创面微生物。方法2018年9月至2019年4月期间前瞻性连续纳入5例确诊为DFO的患者（Dd组:Dd7、Dd8、Dd10、Dd11、Dd15）和5例确诊为无糖尿病的PFO患者（ND组:ND2、ND4、ND5、ND7、ND10）,清创后采集创面深部感染骨组织样品,使用宏基因组测序技术分析其微生物组成,基于Spearman相关性分析探索优势菌种与患者临床指标间的相关性,并通过与KEGG、CAZy、eggNOG、ARDB和VFDB数据库比对获取微生物的功能信息。结果1、宏基因组测序后共获得129G数据,过滤后共获得127G数据基于Illumina NovaSeq对10例骨髓炎感染骨组织样品进行宏基因组测序共获得1.29349×1011bp碱基,861351778条reads,共计129G数据,平均每例样品 12.9G;过滤后共获得 1.2726×1011bp 碱基,846819798 条 reads,共 127G 数据,平均每例样品12.7G;组装后获得95609条Contigs,平均长度为3151.68bp,N50 为 7698bp。2、Dd组菌种多样性和丰度均高于ND组Dd组与ND组菌种维恩图显示存在19.51%的重叠,60.49%的菌种为Dd组特有;丰度聚类热图显示ND组菌种丰度普遍较Dd组低。3、宏基因组测序获得22种优势菌种,其中6种隶属于普氏菌属Dd组与ND组中相对丰度最高的菌种均为肺炎克雷伯菌,其次是韦永氏球菌;Dd组相对丰度排名第三的菌种是中间普氏菌,其次是栖牙普氏菌、Thielavia terrestris和小肠耶尔森菌。在测序获得的22种优势菌种中,隶属于普氏菌属的菌种有6种,在Dd组中的总相对丰度达到13.6%,是Dd组所有菌种中占比最高的,与16S rRNA测序结果一致,验证了宏基因组测序的准确性;宏基因组测序获得的优势菌种中,G-菌占85.71%,G+菌占14.29%;厌氧菌占60.00%,兼性厌氧菌占26.67%,需氧菌仅占13.33%。4、肺炎克雷伯菌与隶属于普氏菌属的菌种呈负相关基于Spearman的菌种相关性分析显示隶属于普氏菌属的菌种均与肺炎克雷伯菌呈负相关;而肺炎克雷伯菌与口腔链球菌正相关性最大（ρ=0.79）,与栖牙普氏菌负相关性最大（ρ=-0.85）。5、普雷沃氏菌科和中间普雷沃菌是Dd组的标记细菌LEfSe分析发现,普雷沃氏菌科（LDA SCORE=5.49;P=0.028）和中间普雷沃菌（LDA SCORE=5.20;P=0.009）是Dd组中前两位最具代表性的核心菌群;其次还包括梭菌门（LDA SCORE=4.39;P=0.028）和梭菌纲（LDA SCORE=4.39;P=0.028）。6、隶属于普氏菌属的菌种均与DFI病程（DFId）呈正相关Prevotella denticola（ρ=0.36）、Prevotella jejuni（ρ=0.46）和 Prevotellafusca（ρ=0.46）正相关性最大的临床指标均为DFId,且与DFId正相关性最大的细菌是P.jejuni（ρ=0.46）和P.fusca（ρ=0.46）;与肺炎克雷伯菌呈正相关的临床指标是Wagner分级（ρ=0.87）,负相关性最大的是DFId（ρ=-0.46）;与WBC、N和CRP等感染指标均呈正相关的菌种是普通变形杆菌,负相关性较大的菌种是脆弱拟杆菌。7、Dd组注释到的通路丰度较ND组高,丰度最高的是糖酵解糖异生通路两组基因的维恩图显示Dd组包含了 ND组的所有基因,ND组基因占Dd组基因总量的12%;将去冗余后的基因集与KEGG数据库比对后获得4626种KO,75630条通路;在LevelA,两组丰度最高的均为新陈代谢通路,其次是遗传信息处理通路;在LevelB,两组丰度最高的均为运输和分解代谢通路,其次是耐药性和感染性疾病通路;在Pathway水平,两组丰度最高的均为糖酵解糖异生通路,其次是氨基酸代谢和同源重组通路。8、Dd组中复制与修复相关的功能基因丰度最高去冗余后的基因集与eggNOG数据库比对,在Dd组中,复制与修复相关的功能基因丰度最高,其次是翻译、氨基酸代谢和运输、细胞膜生物起源等相关的功能基因;在ND组中,氨基酸代谢和运输相关的功能基因丰度最高,其次是复制与修复、翻译等相关的功能基因。9、丰度最高的碳水化合物活性酶是糖基转移酶CAZy数据库注释结果显示,Dd组碳水化合物活性酶的丰度高于ND组,丰度最高的是糖基转移酶,其次是糖苷水解酶。10、Dd组中抗生素抗性基因丰度显著高于ND组宏基因组测序数据与ARDB比对共获得11930条抗生素抗性基因,Dd组抗性基因的数量显著高于ND组（P=0.030）,丰度最高的是链霉素抗性基因,其次是林可酰胺类、大环内酯类及四环素类抗性基因。11、Dd组中丰度最高的毒力因子是Hsp60,其次是ClpC和ClpE宏基因组测序数据与VFDB比对共获得120266条毒力基因,121种毒力因子。Dd组丰度最高的毒力因子是Hsp60,其次是ClpC和ClpE。结论1.宏基因组测序将微生物精确鉴定到种水平,共获得优势菌种22种,DFO中以G-菌、厌氧菌占优势,与16S rRNA测序结果一致,证实了宏基因组测序技术在感染骨组织微生物测序分析中的可行性;2.患者DFI病程较长,ALB越低时越需要警惕普氏菌属的出现,感染指标值较高时出现普通变形杆菌的几率大,感染指标值较低时出现脆弱拟杆菌的几率较大,可以根据DFO患者的临床指标针对性选择经验性抗生素抗感染治疗;3.DFO创面中的微生物包含了PFO创面微生物的所有功能,且丰度更高;DFO创面微生物修复自身损伤的能力很强,可以轻松适应外界环境的变化,碳水化合物可能是其主要能量来源之一,且微生物中抗生素抗性基因和毒力因子丰富,为微生物可能的耐药性划定了一个范围,为后续基础研究和新型抗菌药物的研发提供了思路。