研究背景外泌体（exosomes）是一种直径为30～120 nm的纳米级脂质包裹体结构,广泛存在于血液、唾液、母乳、尿液和脑脊髓液等体液中。大部分真核生物细胞在正常或病理状态下均可分泌外泌体,其富含特定的生物活性分子,包括DNA、RNA（mRNA、non-coding RNA等）、蛋白质和脂质等。外泌体是细胞间通讯的重要载体,细胞释放的外泌体能够被邻近细胞或远距离细胞所摄取,影响受体细胞的表型变化并参与细胞重要的生物学过程,如细胞增殖、机体免疫调节、细胞凋亡、恶性细胞转移等。近年来,外泌体在肿瘤发生发展机制中的作用备受关注,因其在细胞间,特别是在肿瘤微环境中传递生物活性分子,对肿瘤的发生发展机制产生深远的生物学影响,但具体机制尚未完全阐明。磷酸酶与张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog,PTEN）,是细胞内典型的抑癌基因,其通过磷酸酶活性依赖或非依赖形式参与细胞信号传导。PTEN的抑癌功能主要归因于脂质磷酸酶活性的作用,蛋白磷酸酶活性同样参与了细胞内多种生物学过程,包括细胞增殖、迁移和细胞周期。越来越多的证据表明,基因突变、基因沉默和表观遗传修饰将导致PTEN的失活或功能缺失,从而促进了细胞增殖,抑制细胞凋亡,进而诱发肿瘤的发生。PTEN的失活或功能缺失常见于各种恶性肿瘤疾病中,如胶质母细胞瘤、结肠癌、子宫内膜癌等。除此之外,在恶性肿瘤的进展过程中,PTEN抑癌基因的表达水平与蛋白之间存在着定量关系。苯是一种重要的化工原料,广泛应用于化工领域。苯也是一种普遍存在的环境污染物,国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）将苯确认为Ⅰ类致癌物,但苯的致癌机制尚未完全阐明。目前认为,苯代谢产生的活性物质氢醌（Hydroquinone,HQ）能够导致细胞产生大量活性氧自由基,促使细胞进入氧化应激状态,从而导致细胞的DNA损伤,最终致使细胞发生癌变。研究苯暴露引起的恶性肿瘤疾病具有重要的现实意义,尤其是探索外泌体对HQ诱导的恶性化细胞的生物学功能影响和机制,是环境与健康研究方向的崭新领域,为苯毒性作用的防治策略提供新的思路。研究目的本课题主要研究16HBE细胞外泌体对HQ转化后的恶性受体细胞增殖和迁移性状的影响及机制。研究方法CCK-8法测定HQ对16HBE的细胞毒性并计算LC50。确定25μM HQ的染毒剂量,毒性处理16HBE细胞至40代（约29周）,构建HQ诱导的恶性转化细胞（16HBE-t）。细胞形态学分析、细胞增殖实验和软琼脂糖集落形成实验验证16HBE-t细胞的恶性化程度。以16HBE细胞为对照组,qRT-PCR分析不同染毒代数16HBE细胞（15、30、40th 16HBE）PTEN表达水平。超高速离心法分离16HBE细胞上清液外泌体,透射电镜法（TEM）对外泌体进行形态学表征。16HBE细胞外泌体与恶性16HBE-t受体细胞共孵育48 h,PKH67-DAPI外泌体示踪法分析正常16HBE细胞外泌体能否被16HBE-t恶性受体细胞所摄取。CCK-8法和细胞划痕实验分析共孵育后恶性受体细胞（16HBE-t-EXOs）增殖和迁移能力。以16HBE-t细胞为对照组,qRT-PCR和Western blot分析16HBE-t-EXOs细胞PTEN表达水平,并使用PTEN抑制剂（SF1670）处理16HBE细胞外泌体,反证16HBE细胞外泌体通过传递PTEN影响HQ转化的恶性受体细胞的增殖和迁移能力。研究结果1.HQ诱导的16HBE恶性转化细胞（16HBE-t）具有锚定非依赖性生长的形态学特征,能够在软琼脂糖培养基上形成细胞集落,成功构建了HQ诱导的恶性肿瘤细胞模型。2.qRT-PCR分析HQ不同染毒代数16HBE细胞PTEN表达水平,PTEN表达水平随着HQ染毒代数的增多而逐渐降低。3.梯度差异超速离心法能够分离提纯16HBE细胞外泌体,示踪实验结果表明,PKH67染色的16HBE细胞外泌体能够被恶性16HBE-t受体细胞摄取。4.qRT-PCR和Western blot分析发现16HBE细胞外泌体能够使恶性16HBE-t受体细胞PTEN表达水平上升,抑制恶性16HBE-t受体细胞的增殖和迁移性状。5.使用PTEN抑制剂（SF1670）处理的16HBE细胞外泌体影响恶性受体细胞增殖和迁移的能力减弱。研究结论1.HQ转化的恶性16HBE-t细胞PTEN表达水平显著降低。2.16HBE细胞外泌体被恶性16HBE-t细胞摄取。3.16HBE细胞外泌体能够使恶性16HBE-t受体细胞PTEN表达水平上升。4.16HBE细胞外泌体能够传递PTEN信号至恶性16HBE-t受体细胞抑制细胞增殖及迁移能力。