论文部分内容阅读
目的：
课题组曾证明丹参水溶性提取物能有效防治糖皮质激素引起的大鼠骨质疏松，对糖皮质激素诱导的体外骨髓基质干细胞(marrow stromal cell,MSCs)的成脂分化有抑制作用，但对成脂分化的作用机制并不明确。丹参素和丹酚酸B是丹参水溶性提取物的有效成分，本研究通过观察丹参素和丹酚酸B对体外大鼠骨髓基质干细胞成脂分化的影响，以探讨丹参素和丹酚酸B对骨髓基质干细胞成脂分化的调节作用；通过观察丹参素和丹酚酸B对骨髓基质干细胞成脂分化的过程中组蛋白去乙酰基酶(nuclear protein deacetylase Sirtl)、过氧化物酶增殖体激活受体(PPARr)的影响，探讨丹参素和丹酚酸B对骨髓基质干细胞成脂分化的作用机制，从而探讨中药丹参在防治骨质疏松上的作用机制，为发现中药作用新靶标提供科学依据。
方法：
1.大鼠骨髓基质干细胞体外培养及脂肪分化的鉴定：
通过密度梯度离心法和传代贴壁筛选法相结合，分离纯化大鼠骨髓基质干细胞。应用油红染色法、油红染色化学比色法、碱性磷酸酶法和茜素红染色法判断是否成功诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化，间接鉴定骨髓基质细胞。
2.丹参素和丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞分化的影响：
观察不同浓度丹参素和丹酚酸B对成脂分化率、脂蛋白脂酶mRNA的表达和碱性磷酸酶的分泌，判断药物对骨髓基质干细胞经成脂分化能力和成骨分化能力的影响，找出丹参素和丹酚酸B作用的最佳浓度，并与Sirtl特异性配体白藜芦醇、降血脂药辛伐他汀进行比较。
3.丹参素和丹酚酸B对骨髓基质干细胞成脂分化时Sirtl-PPARr途径的影响：
选用传代的大鼠骨髓基质干细胞，把细胞分成：阴性对照组、成脂诱导对照组、成脂诱导+丹参素组、成脂诱导+丹酚酸B组、成脂诱导+白藜芦醇组、成脂诱导+辛伐他汀组。检测PPARr、SirtlmRNA的表达，探讨丹参素和丹酚酸B是否通过Sirtl-PPARr途径影响大鼠骨髓基质干细胞的成脂分化。
结果：
1.大鼠骨髓基质干细胞体外培养及脂肪分化的鉴定结合密度梯度离心法和传代贴壁筛选法，分离纯化得到较为均一成纤维细胞型的MSCs。MSCs成骨诱导后碱性磷酸酶分泌增加、骨节结茜素红染色呈阳性；成脂诱导后出现脂肪细胞，脂滴可被油红O红染，油红染色化学比色值增加，说明分离的细胞具有MSCs特性，可用于检测药物的作用。
2.丹参素和丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞分化的影响：
结合密度梯度离心法和传代贴壁筛选法，分离纯化得到较为均一的大鼠骨髓基质干细胞，经成脂诱导后向脂肪细胞分化。添加脂肪诱导剂后大鼠MSCs分化为脂肪细胞的能力较对照组明显增强，油红染色化学比色的吸光度(P<0.05)以及脂蛋白脂酶mRNA的表达也较阴性对照组明显增强。成脂诱导加药组的成脂分化均比诱导组明显减少，丹参素、丹酚酸B、白藜芦醇和辛伐他汀组脂肪细胞占细胞总数的比例、油红染色化学比色值和脂蛋白脂酶mRNA的表达明显低于单纯诱导组。丹参素的有效浓度是5×10-7mol/L-1×10-6mol/L，用药后第15天时5×10-7mol/L浓度组降低成脂能力最明显；丹酚酸B的有效浓度是1×10-7mol/L-1×10-6mol/L，用药后第15天时5×10-7mol/L浓度组降低成脂能力最明显；白藜芦醇和辛伐他汀从第9天起即明显减少脂肪细胞的形成，第15天时降低成脂能力最明显。丹参素和丹酚酸B降低成脂的能力不及白藜芦醇、辛伐他汀；我们观察到在这些药物在抑制成脂的同时还促进大鼠MSCs成骨分化，丹参素、丹酚酸B、白藜芦醇和辛伐他汀均可增加大鼠骨髓基质干细胞成骨诱导后细胞碱性磷酸酶的含量，在各种药物中1×10-7mol/L辛伐他汀的作用最明显，其中浓度为5×10-7mol/L的丹参素和丹酚酸B在第15天的作用效果最好。
3.丹参素和丹酚酸B对骨髓基质干细胞成脂分化时Sirtl-PPARr途径的影响：
对照组、诱导组和给药组的大鼠骨髓基质干细胞经体外培养后均能表达PPAR γ和SiftlmRNA。经体外成脂诱导后脂肪诱导组MSCs的PPAR γ mRNA表达较对照组明显升高(P<0.05)，但Sirtl mRNA的表达与阴性对照组相比无明显差异。体外成脂诱导后，5×10-7mol/L丹参素、5×10-7mol/L丹酚酸B、1×10-6mol/L白藜芦醇和1×10-7mol/L辛伐他汀各组MSCs的PPAR γ mRNA表达较诱导组明显降低，5x10-7mol/L丹参素组、5×10-7mol/L丹酚酸B组、1×10-6mol/L白藜芦醇组MSCs的SirtlγmRNA表达较诱导组明显升高，但1×10-7mol/L辛伐他汀组MSCs的SirtlmRNA表达与诱导组相比无明显差异。
结论：
丹参素和丹酚酸B均可抑制大鼠骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化，使脂肪细胞生成减少、油红染色化学比色值降低(P<0.05)，脂蛋白脂酶表达减少；还可促进MSCs碱性磷酸酶的分泌(P<0.01)。同时丹参素和丹酚酸B可使PPARγ的mRNA表达减少，使Sirtl的mRNA表达增多，作用与Sirtl特异性配体白藜芦醇相似，提示丹参素和丹酚酸B可能通过Sirtl-PPARr途径来抑制骨髓基质干细胞的成脂分化。