结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,在中国乃至全球其发病率居于第三,死亡率居于第二,具有“高发病率、高死亡率”的特点。结直肠癌在早期的一些轻微症状,易被诊断为其他消化道疾病而忽视,当临床症状明显时,病情已广泛转移而失去手术机会。尽管随着诊断方法和手段的提高,早期发现的病例增多,但是总生存期仍不是很理想,随着研究的进展,晚期患者尽管采用放化疗、靶向治疗及免疫治疗等治疗手段,但疗效也未尽人意,因此,寻找行之有效的分子靶点指导临床个体化精准治疗具有十分重要的意义。胆绿素还原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)是一种进化上高度保守的可溶性NADH依赖酶,广泛分布于动植物细胞浆内,是胆绿素代谢的限速酶,能够促进胆绿素向胆红素转化,也是一种抗氧化剂,能够维持细胞内氧化还原反应的动态平衡,其调节细胞的生长,参与细胞信号转导,能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制肿瘤细胞的凋亡。BLVRA在多种恶性肿瘤中呈高表达水平,但其在结直肠癌中的表达水平及生物学作用尚不明确。汉黄芩素是从黄芩及半枝莲等中药中提取的的一种黄酮类化合物,具有清热解毒之功效,现代研究表明其具有较强的抗肿瘤活性,包括阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、减少肿瘤新生血管形成等方面,同时还可以对化疗药物有增敏作用,且其抗肿瘤作用与多个信号通路有关,而汉黄芩素能否通过调控BLVRA发挥抗肿瘤作用尚未见相关报道。为了探讨BLVRA在结直肠癌中发生发展中的生物学行为,以及汉黄芩素能否通过抑制BLVRA达到治疗结直肠癌的作用。本文通过检测结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中BLVRA表达水平发现其与结直肠癌的发生、发展密切相关。体外实验发现敲低BLVRA的表达,结肠癌细胞增殖能力降低、凋亡率增加、迁移和侵袭能力降低、减少上皮-间充质转化(EMT)进程,而过表达BLVRA的结肠癌细胞生物学活性恰恰相反,提示BLVRA与结肠癌细胞的恶化相关,且BLVRA的相关作用是通过调控Wnt/β-catenin信号通路发生的。汉黄芩素能够通过抑制BLVRA的表达,抑制结肠癌细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力,诱导CRC细胞的凋亡,抑制EMT进程。具体内容包括以下四个部分:第一部分BLVRA在结直肠癌患者中的表达水平及临床意义目的:分析结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中BLVRA的表达情况,探讨其与临床特征的相关性及生存期的关系。方法:收集2015年至2017年扬州大学附属医院经病理确诊的110例结直肠癌患者外周血、活检肿瘤组织及癌旁组织,采用ELISA、qRT-PCR及免疫组化等方法检测BLVRA表达情况,采用卡方检验分析BLVRA的不同表达水平与患者的年龄、性别、发病部位、分期、分化程度、淋巴结及远处转移情况等临床病理特征的相关性,采用Kapla n-Meier法绘制BLVRA不同表达水平的PFS及OS生存曲线,采用对数秩检验比较不同BLVRA表达的累积无进展生存情况及累积总生存差异,分别以性别、年龄、发病部位、分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移、BLVRA表达为自变量,进行单因素及多因素COX回归分析。结果:结直肠癌患者外周血中BLVRA的表达高于健康体检者,其在肿瘤组织及癌旁组织均有表达,但肿瘤组织中表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001),且BLVRA高表达的患者PFS及OS更短(P<0.001)。BLVRA的表达水平与患者分期、分化程度、淋巴结转移及远处转移相关(P<0.001),与患者年龄(P=0.881)、性别(P=0.143)及发病部位(P=0.387)无关。COX单因素分析显示患者分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移及BLVRA表达水平均与患者预后相关(P<0.001),而年龄(P=0.594)、性别(P=0.903)及发病部位(P=0.649)与患者预后无关。COX多因素分析表明患者分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移及BLVRA表达水平均与患者预后相关(P<0.001),而年龄(P=0.220)、性别(P=0.057)及发病部位(P=0.202)与患者预后无关。结论:结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中的BLVRA表达水平明显高于健康体检者及癌旁组织;BLVRA高表达的患者PFS及OS明显缩短,提示预后不良;肿瘤分期、分化程度、淋巴结和远处转移及BLVRA表达水平是影响结直肠癌患者不良预后的独立因素。第二部分BLVRA对结肠癌细胞生物学行为的影响目的:构建BLVRA敲低及过表达载体,体外实验探讨其对结肠癌HT-29及SW620细胞增殖能力、细胞凋亡、迁移和侵袭及上皮-间质转化的影响。方法:首先采用qRT-PCR及Western blot法检测结肠癌细胞F株HHT-29、SW620 SW480、HCT116、LOVO及正常肠上皮细胞FHC中BLVRA mRNA及蛋白表达水平;构建BLVRA敲低及过表达载体和各自的阴性对照载体,进行细胞转染,qRT-PCR及Western blot检测转染后BLVRA mRNA及蛋白水平,证实BLVRA敲低及过表达细胞株成功建立;采用 MTT、流式细胞术、Transwell、免疫荧光、Western blot等方法检测细胞增殖能力、细胞凋亡率及细胞凋亡因子蛋白水平、细胞迁移和侵袭能力及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的变化。结果:qRT-PCR及Western blot结果均显示五株结肠癌细胞株中HT-29细胞的BLVRA mRNA及蛋白表达水平最高(P<0.01),SW620细胞的BLVRA mRNA及蛋白表达水平最低(P<0.05),选择HT-29及SW620细胞进行后续实验;细胞转染后qRT-PCR及Western blot结果显示HT-29细胞中BLVRA mRNA及蛋白表达降低(P<0.001),SW620细胞中 BLVRA mRNA 及蛋白表达升高(P<0.001);敲低 BLVRA后MTT结果显示HT-29细胞增殖能力降低,且随着时间延长,作用明显(P<0.001),流式细胞术提示细胞凋亡率增加(P<0.001),Western blot提示抗凋亡因子Bcl-2及survivin的蛋白水平降低(P<0.05),促凋亡因子BAX及Caspase-7的蛋白水平增加(P<0.05),Transwell结果显示细胞迁移和侵袭数目明显下降(P<0.001),免疫荧光及West6rnblot均显示E-Cadhern表达升高,Vimentin表达下降(P<0.05);过表达BLVRA后MTT结果显示SW620细胞增殖能力提高,且随着时间延长增殖明显(P<0.001),流式细胞术提示细胞凋亡率降低(P<0.001),Western blot提示抗凋亡因子Bcl-2及survivin的蛋白水平升高(P<0.05),而促凋亡因子BAX及Caspase-7的蛋白水平降低(P<0.05),Transwell结果显示细胞迁移和侵袭数目明显增加(P<0.001),免疫荧光结果显示E-Cadherin表达下降,Vimentin表达上升,Weste blot显示出一致的结果(P<0.05)。结论:结肠癌细胞株中BLVRA表达水平均高于正常肠上皮细胞;siRNA-BLVRA能够抑制HT-29细胞的增殖能力、促进细胞凋亡、抑制细胞的迁移和侵袭能力,并通过抑制上皮-间充质转化(EMT)进程来进一步弱化CRC细胞的迁移和侵袭能力,而BLVRA过表达在SW620细胞中则起着相反的生物学作用。第三部分BLVRA影响结肠癌细胞生物学行为的初步机制探讨目的:探讨BLVRA是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路发生作用。方法:采用Western blot检测转染前后结肠癌细胞中Wnt/β-catenin通路及其靶蛋白的表达变化;加予该通路抑制剂(IWR-1)及激动剂(CHIR98014)干预后Western blot检测Wnt/β-catenin通路及其靶蛋白的表达变化。结果:BLRA敲低后Wnt 5a及β-catenin蛋白表达水平下降(P<0.01),p-β-catenin蛋白表达水平上升(P<0.01),靶蛋白cyclin D1、C-myc、p-GSK-3β、COX-2表达下降(P<0.05),p-PTEN表达水平增加(P<0.05),激动剂干预后起着相反的作用(P<0.05);BLVRA过表达后上调Wnt 5a、β-catenin(P<0.01)及靶蛋白cyclin D1、C-myc、p-GSK-3β、COX-2的表达(P<0.05),降低p-β-catenin(P<0.01)及靶蛋白p-PTEN(P<0.05)的表达,抑制剂干预后则起着相反的作用(P<0.05)。结论:siRNA-BLVRA能够抑制Wnt/β-catenin通路,激动剂干预后再次激活Wnt/β-catenin通路;BLVRA过表达则能激活Wnt/β-catenin通路,抑制剂干预后再次抑制Wnt/β-catenin通路,提示BLVRA是通过调控Wnt/β-catenin通路发生作用的。第四部分汉黄芩素调控BLVRA抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭及诱导凋亡的机制研究。目的:探讨汉黄芩素对结肠癌HT-29及SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡及EMT进程的影响,并探讨其是否通过调控BLVRA发生作用。方法:取对数生长期的HT-29和SW620细胞,加入不同浓度的汉黄芩素(0,20,40,80,160μg/mL),并设立 5-FU(12.5μg/mL)为阳性对照组,采用 MTT 法检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞凋亡的影响;通过Transwell实验检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响;Western blot检测细胞凋亡因子Bcl-2、BAX及EMT相关蛋白 E-Cadherin、Vimentin 及 snail 的变化。结果:汉黄芩素抑制结肠癌细胞的增殖能力,且呈现时间及浓度依赖性(P<0.01);汉黄芩素能够提高结肠癌细胞凋亡率,抑制抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,增加促凋亡因子BAX蛋白的表达水平,且随着汉黄芩素浓度的增加作用明显(P<0.01);汉黄芩素能够抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力,且呈现浓度依赖性(P<0.01);Weste blot结果显示汉黄芩素能够增加E-Cadherin的表达,降低Vimentin及snail蛋白的表达水平,且呈现浓度依赖性(P<0.05);汉黄芩素素能降低两种CRC细胞中BLVRA的蛋白表达水平,并且与浓度相关(P<0.05)。结论:汉黄芩素能够抑制结肠癌HT-29和SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡,抑制上皮-间充质转化(EMT)进程,且呈浓度依赖性,其作用可能是通过调控BLVRA的表达产生的。