多样性导向糖基转移酶的结构生物学研究

来源 :华北理工大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:xiaoxiaodeai1002
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:将 N-端含有 His-tag标签的具底物杂泛性的芒果 C-糖基转移酶 MiCGTb通过 Ni-柱进行初步纯化,然后再通过多级 HPLC分离得到高纯度蛋白。通过对不同序列长度的蛋白的结晶条件(包括温度、缓冲液、pH、蛋白浓度、沉淀剂等)的筛选,最终确定适合进行结构研究的蛋白序列长度,得到没有底物(受体或供体)结合的糖基转移酶的晶体结构,并初步确定其催化活性中心。  方法:1、将来源为芒果的已知序列的 C-糖基转移酶 MiCGTb基因通过设计引物克隆扩增连接到pET28载体上,其C-糖基转移酶MiCGTb的N-端含有His-tag标签和TEV酶切位点,构建的pET28-MiCGTb载体在RIPL宿主中表达,IPTG的终浓度为0.2mM,30℃诱导表达,经 Ni-柱进行初步纯化,通过阴离子交换柱再次纯化,最终分离得到高纯度的目的蛋白。  2、将来源为芒果的已知序列的 C-糖基转移酶MiCGTb基因通过蛋白混乱度系统分析,分别将其N-端和C-端的7个和5个氨基酸截去,之后通过设计引物克隆扩增连接到 pET28载体上,截短后的 C-糖基转移酶 MiCGTb(JMiCGTb)的 N-端含有 His-tag标签和 TEV酶切位点,构建的pET28-JMiCGTb载体在RIPL宿主中表达,IPTG的终浓度为0.2mM,30℃诱导表达,经 Ni-柱进行初步纯化,通过阴离子交换柱再次纯化,最终分离得到高纯度的目的蛋白。  3、构建的 pET28-JMiCGTb载体在 B834表达宿主中表达,获得含有稀有元素硒的蛋白,用于异常散射实验获得实验数据4使用初筛结晶试剂盒筛选蛋白结晶的条件,初筛试剂盒为 HamptonⅠ、HamptonⅡ、CRYO1和 CRYO2两个产品的试剂盒,互相弥补彼此之间缺失的结晶条件。初筛和复筛均是采用的16孔悬滴法,经过大量的初筛、复筛以及条件优化最终得到了相对较好的JMiCGTb晶体。  结果:1、优化MiCGTb C-糖基转移酶的表达菌株,采用不同的表达宿主,得到高表达 MiCGTb的菌株。  2、通过采用不同的纯化手段,最终获得高纯度的 C-糖基转移酶MiCGTb可溶性蛋白。  3、获得C-糖基转移酶MiCGTb的单晶以及X-Ray衍射数据。  结论:1、获得高表达的截短的 C-糖基转移酶 MiCGTb表达菌株。  2、获得高纯度的截短的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白。  3、获得截短的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白质单晶。  4、获得一组6埃的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白质单晶X-Ray衍射扫描数据。
其他文献
目前,人们对人才培养更加关注和重视,为了更好的满足时代发展需要,必须培养具有创新创业能力的人才.而对于中医药专业来说,也需要采取合理的措施,对现有中医药专业大学生创新
基于高校教育发展新形势下,高校物理专业教师要主动加强对光学相关课程教学的创新改革工作,结合当代大学生的学习需求特点和市场人才培养要求,优化改善光学教学内容和形式,确
本文通过对荣华二采区10
随着国际之间的交流越来越密切,对于英语的要求也越来越高,对于人才培养的教育体制也要进行相应的改革,因此学校越来越重视对学生英语能力的培养。而在初中英语教学中,词汇教学是非常重要的内容,词汇教学的质量不仅会关系到学生后期英语学习的兴趣和效果,而且对于培养学生养成一个良好的思维习惯和学习方法有着非常重大的意义。  在新课标进行改革之后,学校和教师如何根据新的教学目标对词汇教学进行一个合理科学的规划,进
期刊
该研究应用聚合酶链反应-扩增片段长度多态性分析方法,调查了它们在辽宁汉族、新疆维吾尔族、新疆哈萨克族(以下简称汉族、维族、哈族)三个群体中等位基因分布频率,为它们在
A new concept used for designing large-scale and high-precision NC slideway grinders which are called self-collimation slideway grinders is introduced to elimin
该研究以中药砒霜的有效成分三氧化二砷(AsO)来尝试逆转具有多药耐药表型的人乳腺癌细胞株MCF-7/ADM对阿霉素的耐药性.结论:非细胞毒性剂量的中药AsO可以部分逆转具有MDR表型
高等数学课程是高等院校的重要基础课程,高等数学与课程思政的融合更具有特殊的魅力,为充分凸显高等数学课程浓厚的“思政味”,本文依托高等数学课程思政下的教学改革与实践,
国家自改革开放以来,非常重视对教育的改革,当前国际社会中知识经济的竞争愈演愈烈,世界范围内的人才竞争尤为突出.随着素质教育的不断推进,老师和家长们也已经转变教育观念,
基于现代信息技术基础上的微课教学是运用教学视频为载体.它图文并茂、声色兼备、是教学的有力助手.在小学语文阅读教学实践中,恰当、灵活运用微课,有助于教学情境的创设、教