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心脑血管疾病是一种严重威胁中老年人健康的常见病,位居各类死亡原因之首。大多数心血管疾病的终末期会发生严重的心力衰竭。心力衰竭时氧化应激、心肌细胞凋亡和坏死共存。肿瘤坏死因子α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）可诱导心肌细胞死亡,并在心力衰竭的发生和发展中起重要作用。近年来研究发现,坏死中也存在着一种可以被精确调控的死亡方式—程序性细胞坏死。我们和其他研究组发现,氧化应激可以诱导心肌细胞程序性坏死。然而,氧化应激能否介导TNF-α诱导的心肌细胞程序性坏死及其发生机制迄今尚未阐明。本课题旨在研究是否氧化应激介导TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死及其机制。我们在H9C2心肌细胞培养模型上,首先,验证TNF-α能否诱导心肌细胞程序性坏死及其发生机制;其次,观察TNF-α诱导的心肌细胞程序性坏死是否与活性氧增加有关;随后,探究超氧化物歧化酶和过氧化氢酶复合物EUK134对TNF-α诱导的心肌细胞内ROS含量,细胞死亡率和程序性坏死的影响;最后,探讨NADPH氧化酶抑制剂GSK2795039对TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死的作用及机制。第一部分:TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死呈浓度和时间依赖性目的:验证TNF-α能否诱导心肌细胞程序性坏死及其发生机制。方法:构建不同时间、不同浓度TNF-α诱导的H9C2心肌细胞程序性坏死模型。分4组:（1）对照组（Control）;（2）10ng/ml TNF-α;（3）20ng/ml TNF-α;（4）50ng/ml TNF-α,干预细胞8h、12h、24h后提取蛋白,蛋白印迹法检测RIP1、p-RIP1、RIP3、p-RIP3。结果:1.不同浓度TNF-α处理H9C2心肌细胞8h,与control组比较,10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml TNF-α组RIP1、RIP3蛋白表达倾向于升高,10ng/ml TNF-α组cleaved p-RIP1蛋白表达有升高趋势,50ng/ml TNF-α组p-RIP3蛋白表达升高。2.不同浓度TNF-α处理H9C2心肌细胞12h,与control组比较,10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml TNF-α组cleaved RIP1蛋白表达升高;10ng/ml、20ng/ml TNF-α组p-RIP3蛋白表达趋向于升高。3.不同浓度TNF-α处理H9C2心肌细胞24h,与control组比较,20ng/ml和50ng/ml TNF-α组cleaved RIP1、p-RIP1、RIP3和p-RIP3、蛋白表达增高,而10ng/ml TNF-α组无明显变化。结果提示,TNF-α通过RIP1-RIP3信号通路诱导心肌细胞程序性坏死,且呈浓度依赖性、时间依赖性。第二部分:TNF-α诱导的心肌细胞程序性坏死与活性氧增加有关目的:1.观察RIP1抑制剂NEC-1对TNF-α诱导的心肌细胞程序性坏死的影响。2.观察过氧化氢（H2O2）在心肌细胞坏死和凋亡中的作用。3.观察RIP1抑制剂NEC-1对H2O2诱导心肌细胞程序性坏死的影响。方法:组1:构建TNF-α诱导的H9C2心肌细胞程序性坏死模型,分4组:（1）对照组（Control）;（2）20u M NEC-1;（3）20ng/ml TNF-α;（4）20ng/ml TNF-α+20u M NEC-1,分别干预细胞12/24h后提取蛋白,蛋白印迹法检测RIP1、p-RIP1、RIP3、p-RIP3;干预细胞12/24h后提取细胞,流式测各组坏死率、凋亡率。组2:构建H9C2心肌细胞H2O2实验模型,分4组:（1）对照组（Control）;（2）20u M NEC-1;（3）500u M H2O2;（4）500u M H2O2+20u M NEC-1,干预细胞1h后提取蛋白,蛋白印迹法检测RIP1、p-RIP1、RIP3、p-RIP3;流式测各组坏死率、凋亡率。结果:1.蛋白印迹结果:与Control组相比,TNF-α（20ng/ml）组引起心肌细胞RIP1、RIP3、p-RIP3表达增高,NEC-1可减轻TNF-α诱导的上述指标增高。流式结果:与Control组相比,TNF-α组坏死率和凋亡率明显增高,NEC-1+TNF-α组较TNF-α组坏死率和凋亡率明显下降。提示NEC-1可以保护心肌细胞免于坏死和凋亡。2.流式结果:与control组相比,H2O2组凋亡率和坏死率增高。提示H2O2诱导心肌细胞坏死和凋亡。蛋白印迹结果:与control组相比,H2O2组引起心肌细胞RIP1、RIP3表达增高,NEC-1可抑制上述指标增高。提示H2O2通过RIP1、RIP3通路引起细胞程序性坏死,RIP1抑制剂NEC-1抑制H2O2诱导的心肌细胞程序性坏死。第三部分:抗氧化剂对TNF-α诱导的心肌细胞程序性坏死的影响及机制目的:1.探究超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶复合物EUK134对TNF-α诱导的心肌细胞ROS、死亡率和程序性坏死的影响。2.探讨NADPH氧化酶抑制剂GSK2795039对TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死的作用及机制。方法:组1:构建TNF-α诱导的H9C2心肌细胞程序性坏死模型。分4组:（1）对照组（Control）;（2）50u M EUK134;（3）50ng/ml TNF-α;（4）50ng/ml TNF-α+50u M EUK134,干预细胞24h后提取蛋白,蛋白印迹法检测RIP1、p-RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL、p-MLKL。干预细胞12/24h后提取细胞,采用荧光探针（H2DCFDA）测ROS含量,流式测各组坏死率、凋亡率。组2:构建TNF-α诱导的H9C2心肌细胞程序性坏死模型。分4组:（1）对照组（Control）;（2）25u M GSK;（3）50ng/ml TNF-α;（4）50ng/ml TNF-α+25u M GSK,干预细胞24h后提取蛋白,蛋白印迹法检测程序性坏死关键指标p-RIP3。结果:1.细胞内ROS测量结果,与对照组相比,TNF-α显著增加心肌细胞内ROS,EUK134减轻TNF-α诱导的心肌细胞内ROS增加。2.流式结果,TNF-α诱导心肌细胞坏死和凋亡率显著增加,抗氧化剂EUK134减轻坏死率约25%和凋亡率约30%。3.蛋白印迹结果,抗氧化剂EUK134可抑制TNF-α诱导p-RIP1,p-RIP3和p-MLKL的蛋白表达增高。4.蛋白印迹结果,与Control组比较,TNF-α组p-RIP3表达增高,TNF-α联合GSK组较TNF-α组p-RIP3表达降低。提示NADPH氧化酶源性ROS通过RIP3激活介导TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死。结论:TNF-α通过RIP1-RIP3信号通路诱导心肌细胞程序性坏死,且呈浓度依赖性、时间依赖性。TNF-α通过RIP1-RIP3通路介导心肌细胞程序性坏死与ROS增加有关。TNF-α诱导的ROS介导心肌细胞程序性坏死。NADPH氧化酶源性ROS通过RIP3激活介导TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死。本研究证实氧化应激通过RIP1-RIP3通路介导TNF-α诱导心肌细胞程序性坏死。