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CRISPR-Cas是一种原核生物的抵御外源遗传物质(如质粒和病毒等)的获得性免疫系统。嗜热古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)REY15A编码一个I-A亚型和两个III-B(Cmr-α和Cmr-β)亚型的CRISPR-Cas系统。该菌编码的Csa3家族蛋白(Csa3a和Csa3b)是目前古菌中已知的唯一与CRISPR-Cas系统关联的调控因子。功能研究表明,Csa3a激活CRISPR免疫适应,Csa3b为I-A型干涉复合物的抑制因子。
本研究聚焦由Csa3a和Csa3b组成的调控CRISPR免疫适应的整合途径和由Csa3b参与的III-B亚型CRISPR系统RNA干涉的调控机制。本研究表明,过表达csa3b严重阻碍了S.islandicus细胞的生长,比较转录组发现csa3b过表达上调III-B系统的cmr等基因。通过DNaseIFootprinting和等离子体共振等实验证实Csa3b蛋白特异性结合免疫适应cas操纵子的启动子以及III-B亚型Cmr-α和Cmr-β操纵子的启动子。与野生型菌株相比,csa3b基因缺失菌株能从穿梭质粒pSeSD中获取新间隔序列(Spacer),并且该菌株被STSV2病毒感染之后能从该病毒获取大量的新Spacer。该结果表明Csa3b抑制CRISPR免疫适应。此外与野生型相比,csa3b基因缺失菌株的III-B亚型Cmr系统的RNA干涉能力显著降低,说明Csa3b可以激活Cmr介导的RNA干涉。转录组数据还表明csa3b过表达显著提高DNA复制和修复相关基因(如cdc6-2、tfb3)、DNA损伤响应基因(如Ups系统和Ced系统)等,表明Csa3b可能作为一个全局性的转录因子在细胞中发挥功能。
环状寡聚腺苷酸(cOA)被报道在CRISPR干涉的调控中发挥重要作用,cOA作为信号分子与Csm6、Csx1家族蛋白的CARF结构域结合从而变构激活HEPN结构域的核糖核酸酶活性。然而,信号分子在CRISPR适应过程中调控作用尚未被报道。Csa3是唯一与I型CRISPR-Cas系统关联的CARF家族蛋白,其缺乏C端催化效应域,但与Helix-Turn-HelixDNA结合域融合的二聚体蛋白。本研究证实Csa3b蛋白在体外与一个寡核苷酸分子5’-CAAAA-3’(CA4)结合,且CARF结构域突变降低了与CA4的结合能力,而寡核酸CA4能促进Csa3b蛋白与csa1的启动子的结合能力。同时,csa3b基因过表达严重影响细胞生长,而其CARF结构域突变基因过表达则不能引起生长延迟现象。鉴定了Csa3a蛋白在体外结合cOA和CA4,并且Csa3a的CARF结构域突变在体外影响其与cOA和CA4的结合能力。同时体内实验表明Csa3a蛋白CARF结构域突变不能诱导免疫适应cas基因的表达,从而导致该蛋白不能激发CRISPR免疫适应。表明CARF结构域以及信号分子与CARF结构域的结合对于Csa3蛋白的调控的重要性。
综上所述,本研究揭示了S.islandicus中由Csa3a和Csa3b转录因子介导的CRISPR免疫适应和干涉的变构调节模型。
本研究聚焦由Csa3a和Csa3b组成的调控CRISPR免疫适应的整合途径和由Csa3b参与的III-B亚型CRISPR系统RNA干涉的调控机制。本研究表明,过表达csa3b严重阻碍了S.islandicus细胞的生长,比较转录组发现csa3b过表达上调III-B系统的cmr等基因。通过DNaseIFootprinting和等离子体共振等实验证实Csa3b蛋白特异性结合免疫适应cas操纵子的启动子以及III-B亚型Cmr-α和Cmr-β操纵子的启动子。与野生型菌株相比,csa3b基因缺失菌株能从穿梭质粒pSeSD中获取新间隔序列(Spacer),并且该菌株被STSV2病毒感染之后能从该病毒获取大量的新Spacer。该结果表明Csa3b抑制CRISPR免疫适应。此外与野生型相比,csa3b基因缺失菌株的III-B亚型Cmr系统的RNA干涉能力显著降低,说明Csa3b可以激活Cmr介导的RNA干涉。转录组数据还表明csa3b过表达显著提高DNA复制和修复相关基因(如cdc6-2、tfb3)、DNA损伤响应基因(如Ups系统和Ced系统)等,表明Csa3b可能作为一个全局性的转录因子在细胞中发挥功能。
环状寡聚腺苷酸(cOA)被报道在CRISPR干涉的调控中发挥重要作用,cOA作为信号分子与Csm6、Csx1家族蛋白的CARF结构域结合从而变构激活HEPN结构域的核糖核酸酶活性。然而,信号分子在CRISPR适应过程中调控作用尚未被报道。Csa3是唯一与I型CRISPR-Cas系统关联的CARF家族蛋白,其缺乏C端催化效应域,但与Helix-Turn-HelixDNA结合域融合的二聚体蛋白。本研究证实Csa3b蛋白在体外与一个寡核苷酸分子5’-CAAAA-3’(CA4)结合,且CARF结构域突变降低了与CA4的结合能力,而寡核酸CA4能促进Csa3b蛋白与csa1的启动子的结合能力。同时,csa3b基因过表达严重影响细胞生长,而其CARF结构域突变基因过表达则不能引起生长延迟现象。鉴定了Csa3a蛋白在体外结合cOA和CA4,并且Csa3a的CARF结构域突变在体外影响其与cOA和CA4的结合能力。同时体内实验表明Csa3a蛋白CARF结构域突变不能诱导免疫适应cas基因的表达,从而导致该蛋白不能激发CRISPR免疫适应。表明CARF结构域以及信号分子与CARF结构域的结合对于Csa3蛋白的调控的重要性。
综上所述,本研究揭示了S.islandicus中由Csa3a和Csa3b转录因子介导的CRISPR免疫适应和干涉的变构调节模型。